Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Proteingeler

F 2727Set för att gjuta proteingeler. Set för att gjuta proteingeler. För elektrofores av proteiner rekommenderar jag att man köper färdiggjutna 8 % polyakrylamidgeler. För den som som av ena eller andra anledningen vill gjuta sina polyakrylamidgeler själv kan man använda nedanstående recept. Om man vill använda samma elektroforeskärl som man redan har till agarosgelelektrofores av DNA kan man gjuta en 3 %-ig agarosgel enligt nedanstående recept istället.

Polyakrylamidgel, 8%

Akrylamid är ett starkt nervgift, varför gelen måste tillredas i dragskåp. Skyddshandskar, skyddsglasögon och labrock måste också bäras. Polyakrylamiden som bildas är däremot så gott som helt ofarlig. Receptet ger en gel på 7,5 ml, vilket räcker för en minigel av standardtyp.

  1. Tillred Akrylamid:bis (30:0,8)-lösning:
    1. Lös 6 g akrylamid och 0,16 g bis-akrylamid i 15 ml avjonat eller destillerat vatten
    2. Tillsätt vatten upp till 20 ml
    3. Filtrera genom filterpapper
    4. Skydda lösningen från ljus, och förvara den i kylskåp. Den är hållbar i upp till två månader.
  2. Tillred 1,5 M Tris-HCl genom att lösa 18,2 g TRIS-HCl i 80 ml vatten. Ställ pH till 8,7 och tillsätt vatten upp till 100 ml. Filtrera genom filterpapper och förvara i kylskåp.
  3. Framställ 10%-ig ammoniumpersulfat (APS) genom att lösa 1 g ammoniumpersulfat i 10 ml avjonat eller destillerat vatten. Förvara i kylskåp i upp till två veckor.
  4. Sätt samman gelgjutningsformen enligt tillverkarens anvisningar. Vid behov, tvätta glasplattorna med 70%-ig etanol.
  5. Blanda i en 25 ml E-kolv:
    1. 2,00 ml Akrylamid:bis (30:0,8)
    2. 1,88 ml TRIS-HCl, pH 8,7
    3. 3,50 ml destillerat eller avjonat vatten
    4. 3,5 μl 10%-ig SDS
    5. 3,75 μl TEMED
  6. Tillsätt 37,5 μl APS. När denna tillsatts börjar polymerisationen av akrylamiden.
  7. För med hjälp av en pasteurpipett över lösningen till den monterade gelgjutningsformen.
  8. För i kammen när lösningens nivå nått 10-15 mm från kanten.
  9. Fyll vid behov på mer lösning så att lösningen når upp till kanten över hela gelgjutningsformen.
  10. Sug upp lite gellösning i pasteurpipetten, och lämna den i E-kolven. När du inte längre kan trycka ut lösningen ur pipetten vet du att gelen stelnat också i gelgjutningsformen.
  11. Om man inte ska använda gelen samma dag, kan man försluta den i plast och spara den i kylskåp några dagar.

Agarosgel, 3%

Beroende på vilken typ av gelgjutningsform man använder, behöver man tillreda olika stor mängd agarosgel. Receptet nedan ger 10 ml färdig gel.

  1. Blanda 0,3 g agaros (protein grade) i 8,9 ml destillerat eller avjonat vatten
  2. Tillsätt 1 ml 10x TB-buffert och 0,1 ml 10% SDS
  3. Smält agarosen i mikrovågsugn eller kokande vattenbad.
  4. Häll agarosen i en gelgjutningsform med kam när den svalnat så pass att man kan hålla den i handen utan att bränna sig.
  5. Gelen kan förvaras i tättslutande förpackning i kylskåp i några dagar innan den ska användas.

Coomassie Brilliant Blue infärgningslösning, 500 ml

Lösningen bör tillredas i dragskåp eftersom ättiksyra luktar så starkt. Koncentrerad ättiksyra är också starkt frätande, varför man måste ha labrock och skyddsglasögon på när man tillreder lösningen. Efter infärgning kan man filtrera lösningen genom vanligt filterpapper och återanvända ett flertal gånger.

  1. Lös 2,5 g Coomassie Brilliant Blue i 100 ml avjonat eller destillerat vatten.
  2. Tillsätt
    1. 250 ml 100%-ig metanol
    2. 50 ml 100%-ig ättiksyra
  3. Tillsätt avjonat eller destillerat vatten upp till 500 ml.
  4. Filtrera lösningen genom vanligt filterpapper
  5. Förvara i rumstemperatur

Avfärgningslösning (1000 ml)

  1. Blanda
    1. 100 ml 100%-ig metanol
    2. 70 ml 100%-ig ättiksyra
  2. Tillsätt vatten upp till 1000 ml.
  3. Förvara i rumstemperatur.