Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Antibiotikas inverkan på tillväxthastigheten

Inledning

Vid biotekniskt arbete med bakterier är det för det mesta viktigt att man använder sig av kulturer som befinner sig i logfas. I denna fas frodas bakterierna som bäst och delar sig med maximal hastighet. Du ska i denna laborationen följa hur tillsats av olika antibiotika påverkar bakteriernas tillväxthastighet.

Bakteriernas tillväxt kan man studera genom att föra över bakterierna till en kyvett ocht mäta den optiska densiteten i en spektrofotometer vid 500 nm våglängd (OD500). Ju fler bakterier som finns i lösningen (ju tätare den är), desto mer av ljuset kommer att absorberas på sin färd genom kyvetten. Genom att mäta vid flera olika tidpunkter kan man se hur bakterien följer tillväxtkurvan. I laborationen ska du undersöka både hur kloramfenikol (CAP) och ampicillin (AMP) påverkar E. coli-bakteriens tillväxt.

Tid för detta

Eftersom laborationen tar lång tid, kan det vara lämpligt att låta två omedelbart på varandra följande labgrupper utföra laborationen. Varje grupp utför då några mätningar, och tillsammans följer hela klassen bakteriernas tillväxt i de åtta kulturkolvarna.

Särskilda förberedelser

  1. Ympa kulturer av B. subtilis och E. coli dagen innan.
  2. Sätt på spektrofotometern. Lampan tar ett tag på sig att värma upp sig, varför spektrofotometern måste vara påsatt under hela laborationen.

Material

  • 70%-ig etanol eller annat ytdesinfektionsmedel
  • Övernattskulturer av B. subtilis resp. E. coli
  • 8 st. sterila 200 ml E-kolvar med bomulls-/papperspropp eller 200 ml kulturkolvar med metallhuv
  • Skakinkubator, 37 °C (eller motsvarande)
  • Mikropipett, 1000 μl
  • Spektrofotometer, 500 nm
  • Plastkyvetter, engångs
  • Steril NB (eller LB) som referenslösning
  • Kloramfenikollösning, 10 mg/ml
  • Ampicillinlösning, 50 mg/ml

Gör såhär

  1. Sterilisera din arbetsyta med 70%-ig etanol eller annat desinfektionsmedel.
  2. Numrera de åtta E-kolvarna (kulturkolvarna) 1-8. De olika kolvarna ska ha följande innehåll:

    Kolv nr.

    Bakterie

    Antibiotikum

    Koncentration

    1.

    B. subtilis

    -

    -

    2.

    B. subtilis

    -

    -

    3.

    E. coli

    -

    -

    4.

    E. coli

    -

    -

    5.

    E. coli

    kloramfenikol

    10 mg/50 ml = 0,2 mg/ml

    6.

    E. coli

    kloramfenikol

    10 mg/50 ml = 0,2 mg/ml

    7.

    E. coli

    ampicillin

    10 mg/50 ml = 0,2 mg/ml

    8.

    E. coli

    ampicillin

    10 mg/50 ml = 0,2 mg/ml

  3. Tillsätt 50 ml odlingsmedium (NB eller LB) till vardera kulturkolvarna. Tänk på att du måste arbeta sterilt hela tiden när du jobbar med kulturkolvarna!
  4. Tag ut 0,5 ml från respektive övernattskultur, och tillsätt till rätt kulturkolv. Man ska precis se att det grumlar sig lite. Om det inte gör det, tillsätt lite till.
  5. Mät omedelbart absorbansen på de ny-ympade kulturerna (t = 0) med sterilt odlingsmedium som referens. Värdet ska vara vara mellan 0,05 och 0,10. Gör en tabell i Excel, där du skriver in tiden och absorbansen.
  6. Gör ett XY-diagram i Excel, där du sätter tiden på x-axeln och log(OD500) på y-axeln.
  7. Absorbansmätningarna gör du såhär:
    1. Ta ut kulturkolven ur inkubatorn.
    2. För över 3 ml av bakterielösningen till kyvetten. (Tänk på att arbeta sterilt!) Sätt omedelbart in kulturkolven i inkubatorn igen, så att inte tillväxten avstannar.
    3. Mät absorbansen i spektrofotometern med odlingsmedium (NB eller LB) som referens. Exakt hur man gör brukar stå tryckt på spektrofotometern. Lämna apparaten påslagen.
    4. Skriv ner tiden och absorbansen i din tabell.
    5. Skriv in värdena i ditt Excel-ark allteftersom du gör mätningarna. Kontrollera att diagrammet uppdateras när du skriver in värdena!
  8. När du ser att bakterierna gått in i logfasen (titta i ditt Excel-diagram!), ska du tillsätta antibiotikumet. Tillsätt så mycket att koncentrationen antibiotikum blir 0,2 mg/ml. Tänk på att volymen minskat allteftersom du gjort absorbansmätningarna!
  9. Fortsätt mätningarna tills du ser en tydlig skillnad mellan de behandlade och obehandlade bakterierna, eller tills bakterierna nått stationärfasen.
  10. Beräkna generationstiden för B. subtilis och E. coli (eller avläs den ur diagrammet) med och utan tillsats av antibiotika. (Se textbokens kapitel 3. Bakteriell tillväxt och kemoterapi.)

Frågor att besvara

  1. Vilken var generationstiden för de olika bakterierna?
  2. Tag reda på hur de olika antibiotikumen fungerar ur kemisk synvinkel!
  3. Vad hade de olika antibiotikumen för effekt på bakteriernas tillväxt?

Riskanalys

Laborationen är inte riskfylld. Tänk dock på att levande bakterier inte får hällas rakt ut i vasken, utan måste hällas i ett särskilt kärl för att sedan avdödas genom autoklavering. Som vid allt arbete med bakterier, bör man ha labrock på sig.

 

   

Också intressant: