Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Bakteriers känslighet för antibiotika

Inledning

En del mikroorganismer utsöndrar substanser som verkar hämmande eller dödande på andra mikroorganismer. Alla bakterier och bakterietyper är inte lika känsliga för alla antibiotika, och en del bakterier kan t.o.m. vara helt okänsliga (resistenta) för en del typer av antibiotika.

Antibiotikaresistensen kan bero på att bakterien på grund av sin struktur eller biokemi inte påverkas av antibiotikumet. Till exempel påverkas inte gramnegativa bakterier lika mycket som grampositiva av penicilliner, eftersom dessa hämmar uppbyggnaden av cellväggen. Grampositiva bakterier har ju som bekant mycket tjockare cellvägg än gramnegativa, och påverkas därför mer av penicilliner.

Resistensen mot antibiotika kan också bero på att en (annars antibiotikakänslig) bakterie tagit upp en plasmid med antibiotikaresistensgen. Genen kodar för ett protein som oskadliggör antibiotikumet, vilket gör att bakterien överlever. Du ska i denna laboration studera hur pass känsliga Bacillus subtilis och Escherichia coli är för några olika antibiotika.

Tid för detta

Laborationen tar ett labtillfälle i anspråk för provsättning, och ett (kort) för avläsning.

Särskilda förberedelser

  1. Ympa kulturer av B. subtilis och E. coli dagen innan.

Material

Mastringar från Mast Diagnostics. Mastringar från Mast Diagnostics. Rackla av glas. Rackla av glas.

 

Varje grupp behöver:

  • 70%-ig etanol
  • En övernattskultur av vardera B. subtilis och E. coli.
  • En mikropipett, 200 μl
  • 2 agarplattor med NA eller LA
  • 2 antibiotikaringar, (t.ex. mastring M11 eller S)
  • 1 rackla. Racklan kan man göra själv genom att böja en glasstav eller lång pasteurpipett (av glas) till formen i bilden ovan.
  • Märkpenna
  • Spritlåga eller bunsenbrännare
  • 1 vid bägare (t.ex. 250-ml bägare, låg modell, eller mindre kristallisationsskål) med T-röd för flambering av racklare och pincett

Gemensamt behövs:

  • Inkubator, 25-30°C

Gör såhär

 
  1. Sterilisera din arbetsyta med 70%-ig etanol eller annat desinfektionsmedel, och tänd spritlågan.
  2. Placera racklan och pincetten i bägaren med T-röd. Låt dem vara däri när du inte använder dem.
  3. Märk upp agarplattorna i kanten av bottenplattan. Skriv dina initialer, dagens datum och vilken bakterie du tänker pytsa i.
  4. Ta med hjälp av mikropipett ut 200 μl av den ena av övernattskulturerna och spruta ner den i rätt agarplatta. Tänk på att arbeta sterilt!
  5. Tag ut racklan ur bägaren med T-röd, och flambera den genom att hastigt föra in den i spritlågan så att etanolen antänds. Håll inte kvar racklan inne i spritlågan; då mjuknar glaset, racklan böjer sig och blir obrukbar.
  6. Låt racklan svalna en kort stund. Sprid sedan ut bakteriesuspensionen med hjälp av racklan. Det hjälper om du snurrar på plattan samtidigt som du stryker fram och tillbaka med racklan. Tänk på att sprida bakteriesuspensionen över hela plattan, även längst ut i kanten.
  7. Upprepa steg 3-5 med den andra bakteriekulturen.
  8. Flambera pincetten och placera antibiotikaringarna mitt på vardera platta. Man kan behöva trycka till mastringen på ”knopparna” något (lämpligen med pincetten), så att de säkert ligger an mot agarn och bakterierna. Tänk på att flambera pincetten innan du lägger på nästa antibiotikaring.
  9. Inkubera plattorna upp-och-ner i 25-30°C i minst ett dygn.
  10. Mät hämningszonernas diamter runt varje antibiotikalapp med mm-noggrannhet.

Frågor att besvara

  1. Vilka olika antibiotika finns på den antibiotikaring du använde dig av?
  2. Hur fungerar dessa antibiotika, sett ur biokemisk synvinkel?
  3. Kopiera eller skriv av nedanstående tabell (antibiotikumen kan variera beroende på vilken mastring som används). Fyll i dina egna värden för hämningszonernas storlek.
    Antibiotikum B. subtilis E. coli
    Kloramfenikol    
    Erythromycin    
    Fusidinsyra    
    Oxacillin    
    Novobiocin    
    Penicillin G    
    Streptomycin    
    Tetracyklin    
  4. Kopiera eller skriv av nedanstående tabell (antibiotikumen kan variera beroende på vilken mastring som används). Fyll i "+" för god hämmande förmåga, "-" för dålig hämmande förmåga och "X" för ingen hämmande förmåga. Ange dina egna resultat och vad litteraturen (eller internet) anger.
      G+ G-
    Antibiotikum Eget res. Litt. Eget res. Litt.
    Kloramfenikol        
    Erythromycin        
    Fusidinsyra        
    Oxacillin        
    Novobiocin        
    Penicillin G        
    Streptomycin        
    Tetracyklin        
  5. Hur förväntar du dig att hämningszonerna ska se ut runt de olika antibiotikalapparna för de båda bakterierna? Gör de det? Varför/varför inte?
  6. Vad beror det på att B. subtilis och E. coli är olika känsliga för olika antibiotika?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. Tänk på att både 70%-ig etanol och T-röd är mycket brandfarliga. Vid allt arbete med bakterier bör man ha labrock på sig. De avlästa bakterieodlingarna får inte slängas med de vanliga soporna, utan måste först avdödas genom autoklavering.  

 

   

Också intressant: