Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Bestämning av bakteriofaghalten med plaquemetoden

phage-lambda-plaqueInledning

Plaque från fag λ. Plaque från fag λ. En vanligt förekommande typ av kloningsvektorer är bakteriofager. Du ska i den här laborationen få bekanta dig lite mer med bakteriofag T4 genom att bestämma virushalten i ett okänt prov.

Vissa stammar av E. coli är känsliga för infektion av T4-fagen. Om man blandar ett stort överskott av bakterier med T4-fager och gjuter in dem i agar, kommer man efter ett dygns inkubering se att det bildas en tät matta av bakterier i agarn. Här och var kommer det dock att finnas ett antal små klara fläckar, s.k. plaque, där en fag har infekterat en bakterie.

Plaquet uppstår när en bakteriofag infekterar en bakterie. Efter en stund lyseras bakterien, och de nybildade fagerna sprider sig till de omkringliggande bakterierna, och infekterar dem. När även dessa bakterier lyseras, sprids fagerna på nytt, nya bakterier infekteras och så vidare. Ett plaque är alltså ett litet område av lyserade bakterier i en matta av bakterier. Varje plaque har sitt ursprung i en enda bakteriofag, precis som en bakteriekoloni har sitt ursprung i en enda bakterie.

Man eftersträvar att få mellan 50-300 plaque på en odlingsplatta – mindre än så är inte statistiskt säkert, och fler än så är svårt att räkna. För att kunna få det, måste man ofta späda det ursprungliga provet flera miljoner gånger. I denna laborationen ska du också lära dig hur man gör sådana spädningar med hjälp av en spädningsserie.

Tid för detta

 

Laborationen tar ett laborationstillfälle i anspråk för provsättning, samt ett (kort) för avläsning och beräkningar.

Särskilda förberedelser

Spädningsserie av fagsuspensionen

Spädningsserien görs lämpligast av läraren innan laborationen.

  1. Kalla den ursprungliga fagsuspensionen för rör 1.
  2. Tag ut 100 μl ur rör 1 och sätt till 9,9 ml spädningsbuffert i rör 2. Nu har fagerna spätts 100 ggr.
  3. Tag ut 1000 μl ur rör 2 och sätt till 9,0 ml spädningsbuffert i rör 3. Nu har fagerna spätts ytterligare 10 ggr.
  4. Tag ut 100 μl ur rör 3 och sätt till 9,9 ml spädningsbuffert i rör 4. Nu har fagerna spätts ytterligare 100 ggr.
  5. Tag ut 1000 μl ur rör 4 och sätt till 9,0 ml spädningsbuffert i rör 5. Nu har fagerna spätts ytterligare 10 ggr.

Om fagerna i rör 1 har en halt på fler än 108 fager/ml, fortsätter man spädningsserien på samma sätt som ovan med lämpligt antal rör. Det kan vara lämpligt att fördela spädningarna på labgrupperna, så att man gör odlingar från alla spädningarna. Varje labgrupp bör göra odlingar från två olika utspädningar.

Material

Varje grupp behöver:

  • 2 färdiggjutna NA-plattor
  • Mjukagar, steril
  • 2 sterila provrör med kork
  • Märkpenna
  • 70%-ig etanol eller annat ytdesinfektionsmedel
  • Spritlåga eller bunsenbrännare
  • Mikropipett, 200 μl, med sterila spetsar
  • Mikropipett, 1000 μl, med sterila spetsar
  • 2 olika färdigspädda fagsuspensioner av bakteriofag T4. (kan beställas från Carolina Biological Supply Company)
  • Övernattskultur av T4-känsliga E. coli. (T.ex. E. coli K12, kan beställas från Carolina Biological Supply Company)
  • Parafilm
  • Slaskbägare med desinfektionsmedel.

Gemensamt behövs:

  • Vattenbad, 50 °C
  • Inkubator, 37 °C

Gör såhär

  1. Sterilisera din arbetsyta och tänd spritlågan.
  2. Märk agarplattorna i botten med dina initialer, dagens datum och vilken fagspädning du tänker ha i plattan.
  3. Sätt in agarplattorna i 37 °C-inkubatorn tills du skall använda dem.
  4. Smält mjukagarn och häll c:a 3 ml i vart och ett av provrören. Tänk på att arbeta sterilt! Sätt omedelbart på korken och placera rören i 50 °C-vattenbadet innan agarn hinner stelna igen.
  5. Plocka fram bakteriesuspensionen, den ena fagsuspensionen och motsvarande agarplatta, en pipett inställd på 100 μl, en pipett inställd på 200 μl och sterila pipettspetsar.

I det följande är det viktigt att du arbetar snabbt, så att mjukagarn inte hinner stelna. Det är därför viktigt att du har läst igenom allt, och har förberett med en mikropipett inställd på 200 μl och en på 100 μl innan du sätter igång.

  1. Tag upp det ena provröret med smält mjukagar och torka av det.
  2. För sterilt över 200 μl bakteriesuspension till röret med mjukagar
  3. För sterilt över 100 μl fagsuspension till samma rör
  4. Blanda innehållet genom att rulla röret mellan händerna (som om man gjorde upp eld på ”indianvis”).
  5. Häll över hela innehållet i agarplattan, och vicka runt så att mjukagarn sprider sig jämnt över hela plattan.
  6. Sätt på locket på agarplattan och lämna den att stelna.
  7. Gör likadant med nästa agarplatta och fagsuspension. Släng de använda pipettspetsarna i slaskbägaren och ta nya innan du sätter igång.
  8. När båda plattorna stelnat, slå en remsa parafilm om dem så att det blir alldeles lufttätt. Detta är för att plattorna inte skall torka ut under inkuberingen.
  9. Inkubera båda plattorna med locket uppåt i 37 °C-inkubatorn i 12-24 h.
  10. Räkna antalet plaque på varje platta. Sätt ett märke med märkpenna för varje plaque som du räknar, så att du inte räknar samma plaque två gånger.
  11. Beräkna koncentrationen fager i den ursprungliga suspensionen (rör 1). Räkna med plaquen från den eller de plattorna där de är mellan 50-300 st.

Frågor att besvara

  1. Hur många plaque hade ni på varje platta?
  2. Hur mycket var fagerna spädda i de plattor ni räknade plaque på?
  3. Vilken koncentration hade fagerna i den ursprungliga suspensionen (rör 1)?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. Var försiktig med både spritlåga och varmvattenbad. Det använda biologiska materialet liksom de använda pipettspetsarna måste avdödas genom autoklavering innan man får slänga dem. Som vid allt arbete med bakterier bör man ha labrock på sig under hela laborationen.

 

 

Också intressant: