Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Renovering pågår!

Ursäkta oredan medan vi bygger om…


Notice: Undefined offset: 1 in /var/www/ehinger.nu/public_html/undervisning/templates/meu91/library/Artx/Content/SingleArticle.php on line 95

Bakteriell transformation

Plate spreader Drigalski spatula-glass 2Inledning

En mycket vanlig metod för att överföra genetiskt material till en värdcell, är genom s.k. transformation. Om man har klonat en gen är det ofta så att man har genen i en plasmid, som man vill använda för att föra över genen till en bakterie, som då fungerar som värdcell. För att bakterien ska kunna ta upp plasmiden, måste den vara kompetent.

En del bakterier är naturligt kompetenta, d.v.s. de kan ta upp extracellulärt DNA utan att man behöver behandla dem särskilt. De flesta celler måste man dock först göra kompetenta på ena eller andra viset, t.ex. genom att chocka dem med elektricitet (elektroporera dem). Man tror att chocken får cellmembranet att öppna sig något, vilket gör att DNA i lösningen kan ”slinka in”. De bakterier som används i denna laborationen, E. coli RR1, är dock naturligt kompetenta.

För att man ska kunna se om en bakterie tagit upp en plasmid eller inte, behöver man någon form av selektionsmarkör. Det exempelvis kan vara en gen, som gör att kolonin ändrar färg om man odlar den på ett speciellt medium, eller en antibiotikaresistensgen. I denna laborationen används plasmiden pUC8, som innehåller en ampicillinresistensgen. Det innebär att om bakterierna odlas på ett medium som innehåller ampicillin, kommer endast de celler att överleva, som tagit upp plasmiden (och därmed blivit resistenta mot ampicillin).

Tid för detta

Laborationen tar ett labtillfälle i anspråk för provsättning, och ett (kort) för avläsning och beräkningar. Vid det första tillfället ingår en del kortare väntetider (≤ 20 minuter).

Särskilda förberedelser

  1. Stryk om på NA-plattor den bakteriestam som skall användas 3-4 dagar innan laborationen.
  2. Placera steril NB eller LB i 37 °C-inkubatorn strax innan inkubationen.

Material

Rackla av glas. Varje grupp behöver:

  • Ett eppendorfrör innehållande 10 μl plasmid-DNA (pUC8) i TE-buffert, vid en koncentration på 2 ng/μl. (Man kan använda plasmiden pUC8, men vilken annan plasmid med högt kopietal, och som innehåller en antibiotikaresistensgen bör duga.)
  • Tre petriskålar med lämpligt selektionsmedium, t.ex. näringsagar (NA) med ampicillin (om man använder plasmiden pUC8).
  • Tre sterila eppendorfrör, vart och ett innehållande 250 μl transformationsbuffert
  • Tre sterila eppendorfrör, vart och ett innehållande 500 μl NB eller LB, värmt till 37 ºC.
  • Krossad is i en cellplastmugg eller dubbel pappmugg.
  • Mikropipett, 1000 μl + sterila pipettspetsar
  • Platinaögla
  • Rackla av glas + bägare med T-röd (eller tre engångs-racklor, sterila)
  • Slaskbägare med desinficeringslösning
  • Märkpenna
  • Flytplatta av frigolit.

Gemensamt behövs:

  • 2-3 odlingsplattor med värdbakterier. E. coli RR1, som är naturligt kompetent kan vara ett bra val, men även andra E. coli-stammar som inte är antibiotikaresistenta, och som inte bär på några plasmider kan användas. Dessa bör strykas om 3-4 dagar innan laborationen.
  • 1-2 odlingsplattor med E. coli RR1 som redan är transformerade med den aktuella plasmiden. Dessa bör strykas om på antibiotikainnehållande medium 3-4 dagar innan laborationen.
  • Vattenbad vid 42 ºC
  • Värmeskåp (inkubator) vid 37 ºC

Gör såhär

Dag 1.

  1. Märk upp de tre eppendorfrören med transformationsbuffert med ”1”, ”2” och ”3”, och kyl dem på is i minst 5 minuter. Det är lämpligt att märka rören på locket.

    Transformationsbufferten innehåller positivt laddade joner (K+ och Ca+), som binder dels till de negativt laddade fosfatgrupperna på plasmid-DNA:t och fosfolipiderna i cellmembranen. Därigenom avskärmas laddningarna från varandra, och DNA:t kan närma sig cellmembranet, för att så småningom passera genom de porer som finns där.

  2. Plocka med hjälp av platinaögla 2-3 kolonier från petriskålen med otransformerade bakterier (värdceller), och för över dem till eppendorfrör nr. 1. Man kan behöva skaka rätt rejält för att få loss bakterierna. Sterilisera platinaöglan, och gör likadant med rör nr. 2.
  3. Sterilisera platinaöglan, och plocka 2-3 kolonier från petriskålen med transformerade bakterier, och för över dem till eppendorfrör nr. 3.
  4. Kyl alla tre rören på is i 10 minuter.

    Kylan tros få membranen att ligga stilla, och gör cellerna redo att ta upp plasmiden.

  5. För med hjälp av mikropipett över hela bakterielösningen från rör nr. 2 till röret med plasmid-DNA:t. Stäng röret, och blanda om genom att knäppa med fingret på röret. Pipettspetsen slängs i slaskbägaren. Märk det nya röret ”2a”.
  6. Värmechocka bakterierna i alla tre rören genom att sätta dem i 42ºC vattenbad i exakt 30 sekunder. Till detta behövs den flytande hållaren av frigolit.

    Värmechocken hjälper (på dåligt känt manér) plasmiden att ta sig in i värdcellen.

  7. Tillsätt med hjälp av mikropipett 250 μl NB (eller LB), värmt till 37 ºC till alla tre rören. För att få en jämn suspension av bakterier, kan man behöva dra dem försiktigt upp och ner i pipetten några gånger. Var försiktig så att du inte får upp bakteriesuspension i pipettens inre! Låt bakterierna återhämta sig minst 20 minuter i 37 ºC-inkubatorn. Pipettspetsen slängs i slaskbägaren.

    Tillsatsen av NB gör att bakterierna får lite tid på sig att börja uttrycka antibiotikaresistensgenen innan de sätts på selektionsmediumet.

  8. Märk under tiden tre antibiotikainnehållande NA-plattor i botten, med samma siffror som du märkt eppendorfrören, plus dina (gruppens) initialer, dagens datum, och vilken typ av bakterier som odlas.
  9. Tag med hjälp av en mikropipett ut 250 μl av varje bakterielösning, och sprid dem på respektive platta med hjälp av racklan. Byt spets mellan varje bakterielösning. Om ni använder en rackla av glas, måste denna flamberas m.h.a. T-röd mellan varje bakterielösning. Rotera plattan medan du sprider ut lösningen med racklan, så att bakterierna sprids ut jämnt över ytan.
  10. Försegla dina plattor med lite parafilm eller tejp, och inkubera dem upp-och-ner i 37 ºC till nästa dag.

Dag 2.

  1. Läs av dina plattor och räkna hur många kolonier det finns på platta 1, 2 och 3.

Frågor att besvara

  1. Hur många kolonier hittade ni på platta 1, 2 och 3?
  2. Varför var där så få/så många kolonier på platta 1, 2 och 3?
  3. Hur kan du se om en bakterie transformerats?
  4. På vilken platta finns de bakterier du själv transformerat?
  5. Vilket syfte tjänar platta 1 och 3?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. TRIS och EDTA, som används för att bereda TE-bufferten, kan i pulverform verka irriterande på andningsvägarna. I Europeiska skolor får man endast transformera genetiskt material inom en viss art, men inte mellan olika arter. Det får man dock i USA. De transformerade bakterierna måste, tillsammans med använda pipettspetsar, eppendorfrör o.dyl. autoklaveras efter genomförd laboration, så att alla bakterier dör.

 

   

Också intressant: