Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

PCR – The Polymerase Chain Reaction

Inledning

Idag körs PCR rutinmässigt i sådana här PCR-maskiner. Idag körs PCR rutinmässigt i sådana här PCR-maskiner. PCRthe polymerase chain reaction – uppfanns år 1984 av Kary B. Mullis, La Jolla, USA. Med denna metod kan man amplifiera ett visst DNA-segment, vilket betyder att man gör många kopior av det. I den här laborationen ska du amplifiera ett 500 bp långt DNA-segment från bakteriofag λ.

I laborationen används ett DNA-polymeras från Thermus aquaticus (Taq-polymeras), som är särskilt tåligt vid höga temperaturer. Taq-polymeras, tillsammans med lämplig buffert (PCR-reagens) och DNA att amplifiera, kan köpas från t.ex. Amersham-Pharmacia Biotech, Bio-Rad eller GE Healthcare. Detta protokoll grundar sig på ett sådant PCR-reagens som ger en slutvolym på 25 μl.

Tid för detta

Laborationen tar ett laborationstillfälle i anspråk för själva PCR-reaktionen, och sedan ytterligare 1-2 tillfällen för elektrofores av det bildade DNA:t. Om man använder en PCR-maskin blir det en avsevärd väntetid innan reaktionen körts färdigt. I elektroforesen ingår också en hel del väntetider.

Material

Varje grupp behöver:

  • En mikropipett, 10 μl + pipettspetsar
  • En mikropipett, 50 μl + pipettspetsar
  • Ett eppendorfrör med pellet innehållande PCR-reagens (Taq-polymeras, buffert och nukleotider)
  • En flytplatta av frigolit
  • En (något grövre) pincett
  • 2 μl DNA-lösning, innehållande 50 ng λ-DNA.
  • 2 μl primer-lösning (10 μM) av var primer:

    5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3'
    5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'
  • Autoklaverat avjonat eller destillerat vatten
  • Tidtagarur
  • Ett eppendorfrör med 10x laddningsfärg (Orange G)
  • Material för att analysera DNA:t med agarosgelelektrofores
  • DNA-stege (eventuellt)

Gemensamt behövs:

  • Tre vattenbad inställda på 96 °C, 58 °C och 72 °C.

Gör såhär

 
  1. Sätt 19 μl sterilt vatten till kanten på röret med PCR-reagenset.
  2. Tillsätt 2 μl av vardera primer till kanten på röret (men ej så att det vidrör övriga droppar – detta är för att man ska få ut hela innehållet i pipettspetsen). Använd en ny spets till varje primer!
  3. Stäng locket till röret ordentligt. Knacka röret ordentligt i bordet, så att lösningarna rinner ner till pelleten och löser upp den. Eventuellt kan man använda en bordscentrifug eller mikrocentrifug för att spinna ner dropparna i botten av röret, eller svänga kraftigt med armen à la skidlöpare.
  4. Blanda innehållet i röret ordentligt genom att knäppa på det med fingrarna. (Återigen behöver man spinna ner dropparna i botten av röret.)
  5. Kontrollera att locket är ordentligt stängt. När röret värms upp i vattenbaden kan locket flyga upp (och innehållet flyga ut) om det inte är ordentligt stängt.
  6. För in röret i frigolitplattan, så att åtminstone den nedersta delen av röret (spetsen) är synlig undertill.
  7. Denaturera λ-DNA:t fullständigt genom att sätta ner det i 96 °C-vattenbadet i 2 minuter
  8. Anslut primerarna till λ-DNA:t genom att flytta över frigolitplattan med reaktionsröret till 58 °C-vattenbadet i 60 sekunder. Använd pincetten för att plocka upp och flytta frigolitplattan.
  9. Syntetisera nytt DNA genom att flytta över frigoliten med reaktionsröret till 72 °C-vattenbadet i 30 sekunder.
  10. Denaturera åter λ-DNA:t genom att sätta ner det i 96 °C-vattenbadet, denna gången i 30 sekunder.
  11. Upprepa steg 8-10 15-20 gånger. Avbryt efter punkt 9.
  12. Flytta över frigolitplattan med reaktionsröret till 58 °C-vattenbadet i 5 minuter efter den sista PCR-rundan. På så vis återgår allt DNA till att vara dubbelsträngat igen.

    Olika tillverkare av Taq-polymeras och PCR-reagens rekommenderar ibland olika tider och temperaturer för just sitt polymeras. De instruktioner som ges här ovan ska alltså endast ses som vägledande, och inte absoluta.
  13. Tillsätt 4 μl laddningsfärg (orange G) till hela reaktionsblandningen. Efter detta steg kan man frysa in det amplifierade DNA:t om man inte har tid eller möjlighet att analysera produkterna genast.
  14. Analysera produkterna med hjälp av agarosgelelektrofores. Det kan vara lämpligt att också ha med någon form av storleksmarkör (DNA-stege).

Om man har tillgång till en PCR-maskin kan man använda följande program istället för att använda olika vattenbad:

  1. Start: 96 °C, 2 minuter
  2. Huvudprogram (30 cykler)
    1. 96 °C, 30 sekunder
    2. 58 °C, 1 minut
    3. 72 °C, 30 sekunder
  3. Avslutning: 58 °C, 5 minuter

Frågor att besvara

  1. Hur många band kunde ni se på er gel? Varför det?
  2. Vad händer i de olika vattenbaden under PCR-reaktionen?
  3. Varför amplifierades inte hela genomet på 45 kb, utan bara ett stycke på 500 bp?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. De heta vattenbaden medför risk för brännskador. Brännskador ska behandlas omedelbart. Om du får hett vatten över dig, tag omedelbart av hindrande kläder och spola med kallt vatten i minst 20 minuter. Kontakta läkare vid stora brännskador. Se också riskanalysen för agarosgelelektrofores av DNA.

Tillkännagivande

Den här laborationen har jag inte kommit på själv, utan den följer i princip ett protokoll från tillverkaren av PCR-reagens. Jag har dock skrivit om den och anpassat den till mina behov.

 

   

Också intressant: