Magnus Ehingers undervisning

— Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete med mera.

”Torr” DNA-sekvensering enligt Sanger

Inledning

Ni ska genom att dramatisera DNA-sekvensering enligt Sanger göra så att er lärare ska kunna ta reda på DNA-sekvensen för en oligonukleotid ni valt att sekvensera. Genom att göra detta ska ni förstå principen för sekvensering enligt Sanger.

Tid för detta

Laborationen tar ett laborationstillfälle i anspråk.

Material

Varje grupp behöver:

Primerar och mallar till övningen.

Gör såhär

  1. Läraren delar in er i fyra grupper: Grupp A, C, G och T.
  2. Skicka ut läraren.
  3. Bestäm er tillsammans med de övriga grupperna för den oligonukleotid (mall) er ni ska ”sekvensera” tillsammans med er lärare. Observera att alla ska sekvensera samma mall:
    1. Välj en utav mallarna på pappret med primerar och mallar!
    2. Klipp noggrant ut den mall ni valt!
  4. Kalla in läraren igen!
  5. Varje grupp klipper nu noggrant ut
    1. de fyra primerar ni har fått på papper
    2. samtliga 32 nukleotider er grupp ska använda sig av.
    Lägg märke till att nukleotiderna består dels av ”vanliga” deoxynukleotider, dels ett antal dideoxynukleotider. ”Vanliga” deoxynukleotider brukar man skriva ”dNTP”, där ”N” står för en av de fyra kvävebaserna. På samma sätt, brukar man skriva ”ddNTP” för att beteckna dideoxynukleotiden. Exempelvis skriver man dATP för att beteckna deoxyadenosintrifosfat och ddATP för att beteckna dideoxyadenosintrifosfat.

Nu är det dags för själva DNA-syntesen!

  1. Lägg alla nukleotider i en papperspåse.
  2. Anslut en primer till den mall ni ska replikera.
  3. Stick ner handen i påsen, och ta upp en nukleotid utan att först titta på den.
    1. Passar den? Om inte, lägg tillbaka den, blanda om, och ta en ny.
    2. När ni fått fatt i en nukleotid som passar, så klipp bort de två yttersta fosfatgrupperna från nukleotiden.
    3. Klistra fast nukleotiden på primern/den växande DNA-strängen, på så vis att nukleotidens fosfatgrupp på 5'-kolet täcker DNA-strängens 3'-OH-grupp.
      1. Var det en dideoxynukleotid ni klistrade fast? Kan man bygga på ytterligare nukleotider på denna DNA-sträng? Varför inte?
    4. Repetera steg 8a-8c tills ni har klistrat på en dideoxynukleotid.
  4. Tag bort den nybildade DNA-strängen från er mall-sträng, och anslut den andra primern till mall-strängen.
  5. Gör om steg 7-9 med resterande primerar.
  6. Dela upp de nybildade DNA-strängarna mellan er i gruppen: En person tar hand om alla de längre DNA-strängarna, och en annan tar hand om alla de kortare.

När man gjort dessa fyra reaktioner i verkliga livet, sätter man varje reaktionsblandning i en brunn på en lång agarosgel. När man lägger på en spänning, vandrar de olika fragmenten olika långt i gelen beroende på hur långa de är. Ju kortare ett fragment är, desto längre vandrar det. Nu har det alltså blivit dags att ”köra gelen” i vår torrlab!

  1. De fyra grupperna får ställa sig i korridoren i följande ordning: Grupp A, C, G och T.
  2. Nu ska man ta ett antal steg framåt, beroende på hur långa fragment man bär på. Antalet steg framåt ska vara 12 minus längden på ens fragment. Om ditt fragment är 7 nukleotider långt ska du alltså ta 12 – 7 = 5 steg framåt. Var snäll mot er lärare, och ta ungefär lika långa steg! :-)
  3. När alla tagit de steg framåt de ska, är det dags för läraren att utröna vilken sekvensen på mallen är. Han/hon får naturligtvis inte tjuvkika på någon utav mallarna!

Frågor att besvara

  1. Vilken sekvens kom läraren fram till att er mall hade?
  2. Om er lärare inte kom fram till rätt sekvens, vad berodde det på?
  3. I primern är fosfatgruppen invid guaninen markerad med en stjärna, ”*”. Vad innebär det?
  4. På vilket vis skiljer sig denna torrlab från en riktig DNA-sekvensering med avseende på
    1. Reaktionsblandningens innehåll?
    2. Längden på primern?
    3. Längden på mallen?
    4. Avläsningen av agarosgelen?
  5. Varför upphör DNA-syntesen när en dideoxynukleotid satts in i den växande DNA-strängen?
  6. Förklara varför reaktionsblandningen måste innehålla alla deoxynukleotider, plus en av dideoxynukleotiderna, t.ex. ddATP. Varför räcker det inte med tre av deoxynukleotiderna, och den fjärde i dideoxy-form, alltså t.ex. en reaktionsblandning med dCTP, dGTP, dTTP, och ddATP?
  7. Varför kan man bara ha en typ av dideoxynukleotid i varje reaktionsblandning?

Riskanalys

Laborationen är inte riskfylld.