Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

ELISA – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Pelargon. Pelargon. Den här laborationen grundar sig på ett ”kit” framtaget för skolbruk av Steffens Biotechnische Analysen GmbH, Tyskland. I detta kit ingår alla kemikalier man behöver, inklusive antikroppar och reaktionslösningar. Det enda man behöver tillhandahålla själv är blad från pelargonia samt en pistill att krossa bladen med.

Inledning

Kammens knoppar doppas i extrakt från pelargonieblad. Om det finns virus i bladextraktet (som i lösningen till höger) fastnar viruspartiklarna på antikropparna. Kammens knoppar doppas i extrakt från pelargonieblad. Om det finns virus i bladextraktet (som i lösningen till höger) fastnar viruspartiklarna på antikropparna. Antikroppar, som ju är specifika för ett enda antigen, är mycket lämpliga att använda för att se om ett visst ämne finns i en lösning av proteiner. I den biotekniska världen kan det kanske handla om att man vill se om ett visst protein finns i blodet eller urinen hos en patient, eller om hur stor mängd enzym som finns kvar i ett livsmedel efter att man behandlat det med enzymet.

Virus består ofta av endast en nukleinsyra och ett hölje av proteiner. Så är det också för PFB-viruset (eng. pelargonium flower break virus), som infekterar bl.a. pelargonieblommor. Du ska i den här laborationen undersöka vilka av en uppsättning pelargonier som har blivit infekterade.

Kammarnas knoppar doppas i lösning med konjugerad antikropp. I den lösning där virus redan fastnat, binder den konjugerade antikroppen (markerad med ''*'') också in till viruspartiklarna. Kammarnas knoppar doppas i lösning med konjugerad antikropp. I den lösning där virus redan fastnat, binder den konjugerade antikroppen (markerad med ''*'') också in till viruspartiklarna. Principen för ELISA bygger på att man har en antikropp specifik för det eftersökta ämnet (i vårt fall PFB-viruset) fastsatt antingen i botten på en brunn eller, som i den här laborationen, på knopparna på en specialgjord kam. Kammen doppar man sedan i en lösning som man gjort genom att krossa ett pelargonieblad i buffert, varvid en stor mängd proteiner lösts i bufferten. Om det finns PFB-virus i lösningen, fastnar dessa partiklar på antikropparna. Efter tvätt, doppar man sedan kammen i en lösning som innehåller ytterligare antikropp specifik för PFB-viruset. På de knoppar där viruset fastnat, fastnar då den andra antikroppen på den inbundna viruspartikeln.

Kammarnas knoppar doppas i substratlösning. I lösningen där de konjugerade antikropparna bundit in, gör det konjugerade enzymet att substratet får blå färg. Kammarnas knoppar doppas i substratlösning. I lösningen där de konjugerade antikropparna bundit in, gör det konjugerade enzymet att substratet får blå färg. Den andra antikroppen är konjugerad med ett enzym, som katalyserar omvandlingen av ett färglöst ämne (ett substrat) till ett ämne med blå färg. Man doppar då knopparna på kammen i brunnar som innehåller substrat. I de brunnar där substratlösningen färgas blå, finns det alltså virus, och i de brunnar där lösningen förblir färglös finns det inga virus.

Tid för detta

Laborationen tar ett laborationstillfälle i anspråk.

Material

Varje grupp behöver:

  • En uppsättning reaktionslösningar från kit för ELISA från Steffens Biotechnische Analysen GmbH (varje kit innehåller material för undersökning av 2 × 10 pelargonieblommor)
  • En pistill (mortelstöt)
  • Ett blad från pelargon. Om skolan har pelargonieblommor är det förstås bra, men ännu roligare är det att ta med sig blad hemifrån. 

Särskilda förberedelser

  1. Späd konjugatet genom att pipettera över det till konjugatbufferten (blå). Var noga med att få med allt, även droppar som kan ha samlats i locket.
  2. Ta fram alla reagens, och låt dem få rumstemperatur.

Gör såhär

 

Annons

 
  1. Klipp ut eller välj ut ett blad som är 10-15 cm2, och lägg det i homogeniseringspåsen.
  2. Tillsätt 5 ml homogeniseringsbuffert (gul) med hjälp av den graderade pipetten, och krossa bladet med pistillen. När vätskan färgats grön av frisläppt klorofyll är bladet tillräckligt homogeniserat.
  3. Tillsätt 2 droppar av ert homogenisat till en av brunnarna i den första raden. Lägg märke till i vilken brunn ni satte ert prov; övriga grupper sätter i sina prov i de andra brunnarna. Lämna brunn 11 och 12 (den positiva och negativa kontrollen) tomma.
  4. Från och med denna punkt arbetar hela klassen gemensamt med försöket.

    Placera kammen med PFBV-antikropparna i brunnarna, så att kontrollerna (markerade med grönt och rött) hamnar i brunn 11 och 12. Eventuella virus i provet fastnar nu på antikropparna. Låt kammen stanna i brunnarna i 10 minuter.

  5. Tillsätt under tiden 3 droppar av den spädda konjugatlösningen till vardera brunn (även brunn 11 och 12) i den andra raden av brunnar.
  6. Tvätta kammen i kallt, rinnande vatten i 15-30 sekunder. Det är viktigt att hålla kammen vågrätt, så att inte provlösning från en knopp på kammen stänker på en annan knopp. Slå av så mycket vatten som möjligt när kammen är färdigtvättad.
  7. Sätt ner kammen i brunnarna med konjugatlösningen. Var noga med att kontrollerna åter hamnar i brunn 11 och 12! Nu binder den enzymkonjugerade antikroppen till eventuellt inbundna viruspartiklar. Lämna kammen i brunnarna i 10 minuter
  8. Tillsätt under tiden 3 droppar substratlösning till vardera brunn i den tredje raden. Var noga med att använda en ny pipett, och att inte jobba i direkt solljus, då substratet är ljuskänsligt.
  9. Tvätta kammen på samma sätt som innan när de 10 minuterna förflutit.
  10. Sätt ner kammen i brunnarna i den tredje raden, och låt den sitta i tills man ser en tydlig skillnad mellan den positiva och den negativa kontrollen (5-10 minuter).
  11. Anteckna i vilka brunnar som substratet färgats blått, samt vilka pelargonier som därmed är virussmittade.

Resultat av ett typiskt försök med Steffens ELISA-kit. Resultat av ett typiskt försök med Steffens ELISA-kit.

Frågor att besvara

  1. Vad tjänar den positiva och negativa kontrollen för syfte?
  2. Var er undersökta pelargonia smittad av PFB-viruset eller inte? Jämför med era kamraters resultat, samt med den positiva och den negativa kontrollen!
  3. Förklara med egna ord varför lösningar från smittade blommor färgades blåa!
  4. Kan man vara säker på att prover som inte färgades blå också är fria från virus? Varför/varför inte?

Riskanalys

Laborationen är inte riskfylld. PFB-viruset är fullkomligt ofarligt för människan, och de använda lösningarna kan spolas ut direkt i vasken. Den använda materielen kan slängas som vanligt skräp. Det finns risk att man får fläckar på kläderna av extrakten från pelargoniebladen och substratlösningen, varför labrock ska bäras under hela laborationen.

Tillkännagivande

Den här laborationen har jag inte kommit på själv, utan ursprungligen fått ifrån Steffens Biotechnische Analysen GmbH. Jag har dock skrivit om den och anpassat den för mina behov.

 

 
[Ingen än…]