Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

DNA-bibliotek

Hur ska man kunna isolera en gen från en hel kromosom? En gen är ju en sådan liten del av allt DNA i en cell!

Att göra ett DNA-bibliotek.

Klipp sönder allt DNA i lämpliga småbitar!

Klona varenda liten bit, och för in dem i bakteriofager, bakterier, eller någon annan lämplig värdcell

Sedan är det "bara" att identifiera den klon som bär på den intressanta genen!

Komplicerat? Det blir många kloner!

Ett däggdjurs hela genom är på c:a 3×109 baspar.

En BAC (bacterial artificial chromosome) kan maximalt ta några 100 000 baspar.

Om sannolikheten skall vara 99% att man får med "sin" gen i DNA-biblioteket krävs det 50 000 unika kloner!

Ett elegantare sätt

 

Man gör bara DNA-bibliotek från de celler där genen man är intresserad av uttrycks!

Det görs genom att man tar omvägen över mRNA

  • Är man t.ex. intresserad av gener som tillverkar globin, siktar man in sig på celler som skall differentiera till erytrocyter, där ungefär hälften av mRNA:t kodar för globiner.

Uttryckta gener transkriberas till mRNA

Man isolerar allt mRNA från cellerna i fråga

Med hjälp av omvänt transkriptas gör man sig DNA.

  • Eftersom detta DNA är komplementärt till RNA:t man till en början isolerade från sina celler, kallas det komplementärt DNA eller cDNA (från engelskans complementary).

En extra bonus: Om man klonar eukaryot DNA, måste man se till att intronerna klipps bort när man väl uttrycker sin gen.

  • Det kan man göra genom att ha sitt DNA i en eukaryot värdcell
  • Men i mRNA finns det inga exoner - därför kan man ha sitt DNA i en prokaryot värdcell (bakterie).
  • Detta är ofta (men inte alltid) en fördel, för bakterier är lätta att handskas med.

Vi skall dock se i avsnittet om proteiner och proteiners veckning, att det ibland ändå krävs en eukaryot värdcell till eukaryot DNA.

Hur man gör ett cDNA-bibliotek. Hur man gör ett cDNA-bibliotek.

Hur man identifierar den klon, som tagit upp det eftersökta DNA:t

Man har en agarplatta med kolonier av transformerade bakterier. En eller flera av dessa innehåller den eftersökta genen.

Man trycker ett nitrocellulosapapper mot agarplattan

  • En del av cellerna från kolonierna fastnar på pappret

Pappret behandlar man med en alkalisk lösning för att lysera cellerna och denaturera DNA:t

Pappret får genomsköljas av en lösning med en radioaktivt inmärkt DNA-sond

  • DNA-sonden består av DNA, som man vet (eller hoppas!) är komplementärt till den gen man söker.
  • DNA-sonden måste dessutom vara framställd med t.ex. radioaktivt fosfor eller väte för att man skall kunna särskilja den i ett senare skede.
  • DNA-sonden hybridiserar med DNA:t från bakterierna

Det genomsköljda pappret lägger man nu på en fotografisk film.

Radioaktiviteten kan avläsas på den fotografiska filmen när den framkallas

Den fotografiska filmen jämförs med agarplattan man hade från början, och vilka kolonier - och i slutändan vilken klon - som innehåller den eftersökta genen kan bestämmas.

Problem: Hur gör man en bra sond?

Man kan pröva att använda en DNA från en homolog gen från en annan art

Om man känner till genprodukten (proteinet) kan man sluta sig till DNA-sekvensen utifrån proteinets aminosyrasekvens

  • Man behöver inte nödvändigtvis känna till hela proteinets aminosyrasekvens

 

 

Också intressant: