Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

DNA-sekvensering

Man kan bestämma kvävebassekvensen på långa DNA-molekyler

Informationen i DNA är lika med i vilken ordning (sekvens) kvävebaserna sitter.

Fram till slutet av 1970-talet var det mycket svårt att bestämma sekvensen till och med på DNA som bara var 5-10 baspar långt.

Frederick SangerFrederick Sanger. Detta ändrades helt år 1977, i och med att Frederick Sanger å ena sidan och Alan Maxam och Walter Gilbert å andra sidan utvecklade sina metoder.

Redan år 1980 fick Sanger och Gilbert nobelpriset i kemi för sina metoder.

Sangers dideoxymetod har fått störst spridning, då denna visat sig enklast och ge bäst resultat.

Numera kan man bestämma DNA-sekvenser (sekvensera) på flera tusen baspar på bara några timmar.

En ännu mer spektakulär metod, s.k. shotgun sequencing, har utvecklats på senare tid ur Sangers dideoxymetod. Denna gör att man kan sekvensera hela genom på relativt kort tid.

Sangers dideoxymetod för sekvensbestämning av DNA

 

Man måste ha en primer

Primern måste vara helt korrekt, och inte kunna binda in till mer än ett ställe i det undersökta DNA:t.

Primern måste vara inmärkt på något vis (t.ex. med 32P), för att man skall kunna detektera den.

Man måste ha en mall bestående av enkelsträngat DNA.

Fyra stycken reaktionsblandningar, A, T, C och G:

Dideoxiadenosintrifosfat (ddATP)Dideoxiadenosintrifosfat (ddATP). Reaktionsblandning A: Lämplig buffertlösning + mall + primer + DNA-polymeras + nukleotider (dNTP:s) och dideoxyadenosintrifosfat (ddATP, se bild till höger).

Reaktionsblandningarna T, C och G innehåller samma, utom att de innehåller ddTTP, ddCTP respektive ddGTP i stället för ddATP.

När reaktionen körs, bildas ny DNA-sträng genom att nukleotiderna på vanligt sätt binder till 3'-hydroxylgruppen på den växande DNA-strängen (se bilden nedan till vänster).

När nytt DNA bildas reagerar den inkommande nukleotiden (i detta fall dATP) med 3'-ändans OH-grupp.När nytt DNA bildas reagerar den inkommande nukleotiden (i detta fall dATP) med 3'-ändans OH-grupp.Replikationen avstannar när en dideoxinukleotid (i detta fall ddGTP) satts in.Replikationen avstannar när en dideoxinukleotid (i detta fall ddGTP) satts in.

Det finns betydligt flera "vanliga" deoxynukleotider än dideoxynukleotider i reaktionsblaningen. Detta gör att sannolikeheten att en dideoxynukleotid binder in i den växande DNA-strängen är ganska liten.

Men om en dideoxynukleotid bundit till den växande DNA-strängen (bilden ovan till höger) finns ingen 3'-hydroxylgrupp för nästa nukleotid att binda till!

  • Det innebär att syntesen avstannar.

DNA-sekvensering enligt SangerDNA-sekvensering enligt Sanger.

Längden på det DNA-fragment man får, korresponderar mot kvävebasens position i DNA-molekylen.

De fyr reaktionsblandningarna analyseras med gelelektrofores. Ju kortare DNA-fragmentet är, desto längre vandrar det i gelen. Därigenom kan mallens sekvens läsas av från mönstret i gelen.

De olika reaktionsblandningarna separeras på en agarosgel med hjälp av elektrofores, och längden på de olika fragmenten kan avläsas. Och längden korresponderar ju mot kvävebasens position i DNA-molekylen, så därigenom får man hela sekvensen.

Ovanstående är lite "old school"...

Oftast idag: Inte radioaktivt inmärkt primer, utan fluorescerande dideoxinukleotider. På så vis kan man köra alla reaktionerna tillsammans och analysera automatiskt med hjälp av laser och kapillärelektrofores (se videoklippet nedan).

 

   

Också intressant: