Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Renovering pågår!

Ursäkta oredan medan vi bygger om…


Notice: Undefined offset: 1 in /var/www/ehinger.nu/public_html/undervisning/templates/meu91/library/Artx/Content/SingleArticle.php on line 95

Kloningsvektorer

En plasmid-vektor Kloningsvektorer kommer i minst fem olika smaker: Plasmider, bakteriofager, cosmider BAC:s (Bacterial Artifical Chromosomes) och YAC:s (Yeast Artificial Chromosomes)

Plasmider

Består av cirkulärt (ringslutet) DNA

Mellan 5 000 - 400 000 baspar

Lever ett "eget" liv inne i bakterien

Bakterier kan ta upp DNA genom en process som kallas transformation.

Man kyler bakterierna i nollgradig CaCl2 -lösning.

Sedan värmechockar man dem i temperaturer uppemot 37-43°C.

Nu blir bakterierna kompetenta: De kan ta upp extracellulärt DNA (DNA utanför cellen)

Endast ett fåtal bakterier (i storleksordningen en på tiotusen - eller ännu färre!) tar upp plasmiden i fråga

Man behöver en metod för att skilja ut (selektera) den eller de celler som tagit upp plasmiden!

Vanligen konstruerar man sin plasmid så, att den innehåller ett antal antibiotikaresistens-gener.

  • Antibiotikaresistens-generna fungerar som selektionsmarkörer .

Genom att platta ut sina bakterier på en agarplatta som innehåller antibiotika, kan man se vilka bakterier som tagit upp plasmiden: Endast de som tagit upp plasmiden är ju antibiotikaresistenta!

En plasmid-vektor En plasmid-vektor.

Detta visar bara att plasmiden tagits upp. Hur skall vi veta att även "vårt" DNA ligerats i plasmiden?

T.ex. genom att ha en restriktionsplats mitt i en annan resistensgen.

  • Om plasmiden innehåller "vårt" DNA, har den förlorat resistens för ett visst antibiotikum
  • Man tar några bakterier från en koloni som har överlevt den första antibiotikan, och testar om de överlever på det andra antibiotikumet.
  • Överlever inte? Kolonin innehåller "vårt" DNA!

Man kan också länka "sitt" DNA med en annan resistensgen.

  • Om bakterierna växer på medium med både det första och det andra antibiotikumet, har det tagit upp "vårt" DNA.

Bakteriofager

Med plasmider kan föra in vanligtvis upp till 1 000–10 000 baspar i en värdcell, men upp till 15 000 baspar har rapporterats. För större DNA-segment kan bakteriofager vara lämpliga.

Bakteriofag λ kan utan vidare leverera hela sitt genom på 48 502 baspar in i en E. coli -cell.

Ungefär 1/3 av bakteriofag λ:s genom behövs inte för överföringen.

  • Detta "onödiga" DNA kan klippas bort med restriktionsenzymer
  • I stället kan man med hjälp av DNA-ligas klistra in upp till 23 000 baspar, innehållande den gen man själv är intresserad av.

Det rekombinanta λ-DNA:t kan föras in i viruspartiklar genom att man blandar dem med extrakt från infekterade celler, vilka innehåller alla proteiner som behövs för att sätta ihop kompletta viruspartiklar.

  • Detta kallas för in vitro-paketering.

Cosmider

Cosmider kan sägas vara rekombinanta plasmider, som kombinerar egenskaper från bakteriofag λ och plasmider

Cosmider är utformade för att klona upp till 45 000 baspar.

En bra (användbar) cosmid är utformad på följande sätt:

  1. Litet, ringformat DNA, typiskt 5 000 till 7 000 baspar
  2. ORI (origin of replication, replikationsursprung)
  3. En eller fler selektionsmarkörer
  4. Ett antal unika restriktionsställen
  5. Ett s.k. cos-ställe (en DNA-sekvens från bakteriofag λ, som krävs för paketering)

Cosmiderna packas in vitro i fagpartiklar.

När cosmiden kommit in i bakteriecellen, sprids den som en plasmid.

Bacterial och Yeast Artificial Chromosomes (BAC:s och YAC:s)

Mycket stora DNA-fragment (50 000 - 100 000 baspar och över) kan klonas.

Jäst (eng. yeast ) är en viktig värd för eukaryot rekombinant DNA.

 

   

Också intressant: