Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Restriktionsenzymer kan klippa i DNA-molekylen

Restriktionsenzymer

Ett restriktionsenzym är ett enzym, som "klipper" isär dubbelsträngat DNA (dsDNA) vid speciella ställen.

Varje restriktionsenzym känner igen specifik DNA-sekvens, där det klipper (endast där).

Igenkänningssekvensen är som regel ett palindrom av kortare eller längre längd.

Några exempel på restriktionsenzymer

Enzym Värdorganism Klyvningsställe
(markerat med ett "^")
EcoRI E. coli 5'-G^A A T T C-3'
3'-C T T A A^G-5'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'-G^G A T C C-3'
3'-C C T A G^G-5'
HinDIII Haemophilus influenzae 5'-A^A G C T T-3'
3'-T T C G A^A-5'
ThaI Thermoplasma acidophilum 5'-C G^C G-3'
3'-G C^G C-5'

 

Många restriktionsenzymer lämnar efter sig "klibbiga ändar" ("sticky ends"):

BamHI komplexbundet med DNABamHI komplexbundet med DNA. Klibbiga ändar = ett överhäng av ssDNA

Ex: EcoRI

5'-G
3'-C T T A A

Även BamHI och HinDIII ger klibbiga ändar

Några restriktionsenzymer ger "trubbiga ändar" ("blunt ends"):

Trubbiga ändar = inget överhäng av ssDNA

Ex: ThaI

5'-C G
3'-G C

Vad kan man ha restriktionsenzymer till?

 

Annons

 

Lätta svaret: Klippa DNA!

Svåra svaret (på frågan "Varför vill man klippa DNA, då?"):

Man vill analysera DNA:t, och skaffa sig hanterliga segment att arbeta med.

Man vill arbeta med en speciell gen, och är intresserad av att klippa ut den och endast den genen.

Agarosgelelektrofores

Om man klipper upp DNA med ett restriktionsenzym, kommer man att få ett antal olika DNA-fragment av olika längd.

För att kunna analysera olika DNA-fragment, måste man kunna separera dem! Göres m.h.a. gelelektrofores, ofta agarosgelektrofores

Vad är elektrofores?

Ett sätt att separera ämnen (partiklar) i en gel

Vad är en gel?

En gel är ett halvfast material med samma konsistens som – you guessed it! – gelé.

Vad är agarosgelelektrofores?

Gelen man använder är gjord av agaros, ett ämne som utvinns ur alger och ger en gelatinös massa.

Andra elektroforesmetoder

PAGE (polyakrylamidgelelektrofores)

Kiselgelseparation

...

Hur gör man agarosgelelektrofores rent praktiskt?

Gelen

För DNA är det lämpligt med 0,8% agaros i TBE-buffert.

  • TBE-buffert: Buffert innehållande TRIS, borsyra, EDTA (och lite NaOH).
  • Eftersom DNA:t är en laddad molekyl (det gäller så gott som alla makromolekyler) krävs en speciell buffert för att det skall "trivas", och inte falla ut eller denatureras.
  • TBE-bufferten är speciellt avpassad för att DNA skall trivas i agarosgelen.

Agarosen i bufferten smälter man, lämpligtvis i mikron.

När den smälta gelen svalnat till c:a 50°C (så att man kan hålla den i handen utan att bränna sig), häller man ut den i en låg vanna.

  • Om gelen är för varm, riskerar man förstöra vannan.

I (den ännu flytande) gelen sätter man ner en s.k. kam.

  • Kammen gör att det bildas brunnar i gelen.

I brunnarna som bildas, kan man så småningom applicera sitt DNA.

Gelen lämnas att stelna.

  • Om gelen inte skall användas omedelbart, kan man lägga den i kylen i en plastpåse tillsammans med en fuktad pappershandduk. Då torkar den inte ut tills man skall använda den.

Applikation av DNA

 

Annons

 
Man häller på TBE-buffert tills det täcker gelen, och tar bort kammen.

Brunnarna skall också vara fyllda

Till sitt prov måste man först sätta loading dye (applikationsfärg, laddningfärg, loading buffer - kärt barn har många namn!)

Laddningsfärgen innehåller:

  1. Färgämne
    • Detta har en negativ laddning, och vandrar således också i gelen när man kör den. På så vis kan man se hur långt man har kört sin gel, och när det är dags att avbryta elektroforesen.
  2. Sukros
    • Detta för att ens prov skall få högre densitet än den omkringliggande bufferten: Då rinner ens prov ner i brunnen, och stannar där, när man applicerar det
  3. En buffert
    • För att ens prov skall trivas, förstås...
  • Har man tänkt efter före, har man precis så mycket prov som ryms i brunnarna
  • Viktigt är att inte "spilla" utanför - då riskerar man kontaminera proven i de intilliggande brunnarna!
  • Av samma anledning måste man också anstränga sig att inte få några bubblor med i brunnen.

Med hjälp av en mikropipett tillsätter man en lämplig mängd av sitt prov till brunnarna.

Köra gelen

Man sätter en elektrod i var ände utav vannan, som gelen ligger i.

DNA:ts laddning är (–)

Den positiva (+) elektroden är den som DNA:t vandrar mot - måste vara "i andra änden" av gelen

Lägg på spänning

  • I "proffsgeler", s.k. minigeler: 150-200V, 1-2h

Korta DNA-segment har lättare att vandra genom gelen än stora - korta möter mindre motstånd i gelen, och därför går det fortast

  • Jfr. lillebrorsan på Konsum med mamma, som går med kassarna fyllda med mat.

När färgen har nått änden på gelen, är det dags att avbryta elektroforesen!

Färga gelen

Rent DNA syns inte på gelen med blotta ögat.

DNA:t måste färgas in på ena eller andra viset för att kunna detekteras!

Ofta färgar man in geler med hjälp av etidiumbromid (nedan till vänster), som blandas i agarosgelen.

 

EtidiumbromidEtidiumbromid. Etidiumbromid interkalerar med DNA. Etidiumbromid interkalerar med DNA.

Etidiumbromid interkalerar med dsDNA, d.v.s. det lägger sig emellan de två DNA-strängarna (ovan till höger). Detta gör att DNA:t fluorescerar om man belyser det med UV-ljus.

Oftast tar man en bild av gelen under UV-ljus, eller så skär man ut sitt upprenade DNA medan gelen ligger på ett UV-bord.

 

   
[Ingen än…]