Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Ett proteins aminosyrasekvens kan bestämmas

Pehr Edman (1916-1977) utvecklade under sin tid som professor i Lund 1947-1957 för att bestämma en oligopeptids sekvens.

Hans metod kallas helt enkelt för Edman-degradation

Edman-degradation

1. Klipp av den yttersta aminosyran (på aminoterminalen)

Ett protein har en aminoterminal och en karboxylsyraterminal.

Fenylisotiocyanat (PITC, ofta även kallat "Edman-reagens") sätts till en lösning av proteinet som skall sekvensbestämmas.

PITC reagerar med aminoterminalen

Man surgör lösningen med 6M saltsyra

Nu avspjälkas den första aminosyran tillsammans med PITC i något som kallas ett fenyltioahydantion-derivat av aminosyran.

2. Separera derivatet från resten av proteinet

3. Analysera derivatet analyseras

Man tar alltså reda på vilken aminosyra det rör sig om

4. Upprepa steg 1-3 tills hela proteinet sekvenerats

Principen för Edman-degradation

Sekvenatorer

Edmandegradation kan idag utföras automatiskt, av maskiner

Dessa maskiner kallas sekvenatorer

Moderna sekvenatorer har mycket hög tillförlitlighet

  • Mer än 99% effektivitet i varje reaktionssteg
  • Lägre tillförlitlighet, gör att felprocenten ökar för varje aminosyra som avspjälkas

Att sekvenera ett helt protein

Tillförlitligheten i varje reaktionssteg minskar för varje avspjälkad aminosyra

  • Därför: Edmandegradation är lämligt endast för oligopeptider

Stora proteiner måste först klippas upp något, till oligopeptider

  • Görs t.ex. med proteaset trypsin
  • Nu sekveneras trypsinfragmenten.

Men hur avgöra i vilken ordning trypsinfragmenten kommer i proteinet?

  • Klyv proteinet också med ett annat enzym eller reagens.
  • Nu skapas andra fragment, som man måste sekvenera

De två fragmenttyperna överlappar varandra, och kan endast göra det på ett sätt – korrekt sätt! smile

 

   

Också intressant: