Pehr Edman (1916-1977) utvecklade under sin tid som professor i Lund 1947-1957 för att bestämma en oligopeptids sekvens.
Hans metod kallas helt enkelt för Edman-degradation
Edman-degradation
1. Klipp av den yttersta aminosyran (på aminoterminalen)
Ett protein har en aminoterminal och en karboxylsyraterminal.
Fenylisotiocyanat (PITC, ofta även kallat "Edman-reagens") sätts till en lösning av proteinet som skall sekvensbestämmas.
PITC reagerar med aminoterminalen
Man surgör lösningen med 6M saltsyra
Nu avspjälkas den första aminosyran tillsammans med PITC i något som kallas ett fenyltioahydantion-derivat av aminosyran.
2. Separera derivatet från resten av proteinet
3. Analysera derivatet analyseras
Man tar alltså reda på vilken aminosyra det rör sig om
4. Upprepa steg 1-3 tills hela proteinet sekvenerats
Sekvenatorer
Edmandegradation kan idag utföras automatiskt, av maskiner
Dessa maskiner kallas sekvenatorer
Moderna sekvenatorer har mycket hög tillförlitlighet
- Mer än 99% effektivitet i varje reaktionssteg
- Lägre tillförlitlighet, gör att felprocenten ökar för varje aminosyra som avspjälkas
Att sekvenera ett helt protein
Tillförlitligheten i varje reaktionssteg minskar för varje avspjälkad aminosyra
- Därför: Edmandegradation är lämligt endast för oligopeptider
Stora proteiner måste först klippas upp något, till oligopeptider
- Görs t.ex. med proteaset trypsin
- Nu sekveneras trypsinfragmenten.
Men hur avgöra i vilken ordning trypsinfragmenten kommer i proteinet?
- Klyv proteinet också med ett annat enzym eller reagens.
- Nu skapas andra fragment, som man måste sekvenera
De två fragmenttyperna överlappar varandra, och kan endast göra det på ett sätt – korrekt sätt! 😊
