Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Undersökning av succinatdehydrogenas

Inledning

I ett av stegen i citronsyracykeln elimineras väte ifrån succinat (bärnstenssyra), varpå det bildas fumarat (fumarsyra). Det sker under inverkan av enzymet succinatdehydrogenas, och samtidigt bildas FADH2. Succinatdehydrogenaset sitter i mitkondriens inre membran, och deltar också direkt i elektrontransportkedjan. Alltsammans sker enligt nedanstående reaktionsformel:

Succinat + FAD → Fumarat + FADH₂

 

Annons

 

I cellandningen är syrgas den slutliga väteacceptorn (det bildas då vatten), men man kan också använda metylenblått. När den reduceras övergår den från blå färg till färglös. Genom att mäta hur lång tid det tar för metylenblått att avfärgas i närvaro av succinatdehydrogenas kan man få ett (grovt) mått på enzymets aktivitet.

Material

Varje grupp behöver

Kemikalier Annan materiel
  • 3 ml PBS (fosfatbuffrad saltlösning, pH = 7,4)
  • 10 ml avjonat vatten
  • 5 ml dinatriumsuccinat, 0,2 M
  • 1,5 ml malonsyra, 0,4 M
  • 2,5 ml metylenblått, 0,1 % i etanol
  • 2 ml jästsuspension, normal
  • 1 ml jästsuspension, kokt (men vid rumstemperatur)
  • Paraffinolja
  • 4 provrör
  • Provrörsställ
  • 7 st 3ml-dropprör av plast, graderade
  • Märkpenna

Gemensamt behövs

  • Vattenbad, 40 °C

Gör såhär

  1. Märk de fyra provrören 1-4 och fyll dem med innehåll enligt nedan. Börja med att hälla buffert i alla provrören (använd ett graderat dropprör av plast). Häll därefter i vatten i alla provrören, natriumsuccinat och så vidare. Byt dropprör efter varje ämne.
    Provrör nr. 1 2 3 4
    Buffert (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5
    Vatten (ml) 2,5 2,0 2,5
    Natriumsuccinat (ml) 0,5 0,5 2,5 0,5
    Malonsyra (ml) 0,5 0,5
    Metylenblått (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5
    Jästsuspension, normal (ml) 0,5 0,5 0,5
    Jästsuspension, kokt (ml) 0,5
  2. Blanda innehållet i provrören genom att skaka dem försiktigt.
  3. Häll omedelbart ett 2 cm tjockt skikt av paraffinolja.
  4. Sätt ner provrören i vattenbadet.
  5. Låt provrören vara i vattenbadet i åtminstone 30 minuter. Notera i vilken ordning provrören avfärgas.
  6. När försöket avbryts, notera vilken färg lösningarna i de olika provrören har.
  7. De använda lösningarna kan hällas ut direkt i avloppet. Provrören diskas med diskmedel och sköljs ur med avjonat vatten.

Frågor att besvara

  1. Redovisa dina resultat i tabellform.
  2. Skriv strukturformeln för succinat och malonsyra.
  3. Hur påverkar malonsyran succinatdehydrogenasets aktivitet?
  4. Förklara varför vart och ett av rören avfärgades i den ordning de gjorde.
  5. Vad skulle ha skett om man inte haft med paraffinoljan?

Riskanalys

Laborationen är inte riskfylld. Malonsyra är irriterande vid förtäring. Metylenblått kan ge svårborttagna fläckar på kläderna, varför labrock ska bäras under hela laborationen. Alla lösningar kan hällas ut i avloppet efter färdig laboration. Provrören diskas med diskmedel och sköljs med avjonat vatten.

Tillkännagivande

Den här laborationen har jag inte kommit på själv, utan inspirerats av från Göteborgs Universitet. Jag har dock skrivit om den och anpassat den till mina behov.

 

   
[Ingen än…]