Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Kemi 2

Administration

Undersökning av en en­zym­ka­ta­ly­se­rad re­ak­tions pH-be­ro­en­de (μ-version)

Artikelindex

Det här är samma laboration som "Undersökning av en en­zym­ka­ta­ly­se­rad re­ak­tions pH-be­ro­en­de", men anpassad efter att köras i eppendorfrör istället. Den här laborationen är än så länge otestad.

Inledning

Enzymer fungerar genom att öppna en ny och snabbare reaktionsväg. Hur snabbt reaktionen sker beror dock på många olika saker. Det kan vara

  • enzymets koncentration
  • substratets koncentration
  • lösningens pH
  • temperatur
  • närvaro/frånvaro av inhibitorer
  • m.m.

I det här försöket ska ni undersöka hur lösningens pH påverkar enzymet fosfatas.

Fosfatas är ett enzym som katalyserar spjälkningen av en fosfatgrupp från en fosfatester. Det är ett relativt ospecifikt enzym, vilket innebär att många olika fosfatestrar påverkas av det. Detta ska ni utnyttja i den här laborationen, där ni ska hydrolysera p-nitrofenylfosfat till p-nitrofenol (se bilden nedan).

Fosfatas katalyserar hydrolys av fosfatestrar.

Det fina med att använda p-nitrofenylfosfat är att den är färglös, medan reaktionsprodukten p-nitrofenol är starkt gul i alkalisk lösning. Därför kan man lätt mäta p-nitrofenolkoncentrationen med hjälp av en spektrofotometer vid 405 nm. Eftersom absorbansen är proportionell mot koncentrationen p-nitrofenol, kan man jämföra hur mycket p-nitrofenol som bildas vid olika pH.

Material

Varje grupp behöver:

  • Enzymlösning: 600 μl fosfataslösning (surt fosfatas från potatis), 0,10 mg/ml. Denna ska förvaras på is tills den sätts ner i 37 °C-vattenbadet.
  • Substratlösning: 600 μl p-nitrofenylfosfatlösning, 1,00 mg/ml
  • 240 μl 0,1 M citratbuffert 1, pH = 4,0
  • 240 μl 0,1 M citratbuffert 2, pH = 4,8
  • 240 μl 0,1 M citratbuffert 3, pH = 5,6
  • 240 μl 0,1 M citratbuffert 4, pH = 6,3
  • 240 μl 0,1 M citratbuffert 5, pH = 7,0
  • 6,0 ml 0,5 M NaOH
  • 6 eppendorfrör
  • 6 plastkyvetter till spektrofotometern
  • Vattenbad, 37 °C
  • Märkpenna med fin spets
  • Mikropipett, 1000 μl + pipettspetsar
  • Mikropipett, 200 μl + pipettspetsar
  • Eppendorfrörsställ
  • Flytblock för eppendorfrör
  • Tidtagarur/mobiltelefon

Gemensamt behövs:

  • Spektrofotometer med wolframlampa (405 nm). Tänk på att spektrofotometern måste vara på minst en halvtimme innan den stabiliserats så att man kan ta upp tillförlitliga mätningar på den.
  • Vattenbad, 37°C

Gör såhär

 
  1. Märk de sex eppendorfrören från 1-6.
  2. För med hjälp av mikropipett över 80 μl substratlösning till vart och ett av de sex eppendorfrören.
  3. För med hjälp av mikropipett över 240 μl av citratbuffert 1 till rör nummer 1; 240 μl av citratbuffert 2 till rör nummer 2 och så vidare. Glöm inte att byta pipettspets mellan varje buffert!
  4. Tillsätt med hjälp av mikropipett 320 μl destillerat eller avjonat vatten till eppendorfrör nr. 6 (blank).
  5. Stäng locken på alla rören och sätt dem tillsammans med enzymlösningen i vattenbadet. Låt dem stå där 2 minuter så att de värms upp till 37 °C.
  6. För med hjälp av mikropipett över 80 μl av enzymlösningen till provrör nummer 1. Stäng locket och blanda om genom att knäppa kraftigt på röret med ett finger. Starta samtidigt tidtagaruret.
  7. Efter 60 sekunder tillsätter du på samma vis enzymlösning till rör nummer 2, och så vidare ända till och med rör nummer 5.
  8. När exakt 10 minuter har gått, tillsätter du med hjälp av mätpipett 800 μl 0,5 M NaOH till det första röret. Stäng locket och blanda om genom att knäppa ordentligt på röret med fingret. Då avbryts reaktionen. När exakt 11 minuter har gått gör du på samma sätt med rör nummer 2, och så vidare med alla de övriga provrören, och även rör nummer 6.
  9. För över reaktionslösningen i rör nummer 1 till en kyvett.
  10. Mät absorbansen vid 405 nm med lösningen i rör 6 som referens.
  11. Gör likadant med rör 2-5.
  12. Gör ett diagram där du sätter av absorbansen på y-axeln mot reaktionslösningens pH på x-axeln.

Frågor att besvara. 

  1. Läs av ditt diagram. Vilket är fosfatasets pH-optimum (vid vilket pH sker reaktionen snabbast)?
  2. Vilket pH-optimum anger enzymtillverkaren att fosfataset har? Överensstämmer det med era mätningar? Varför/varför inte?
  3. Varför fungerar inte fosfataset lika bra vid alla pH?
  4. Varför är det viktigt att alla reaktionerna avbryts efter samma tid? Vad händer om man inte gör det?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. P-nitrofenylfosfat är giftigt vid förtäring och inandning, och kan också verka skadligt vid hudkontakt. NaOH i den koncentration och mängd som används i laborationen är inte riskfyllt. Labrock ska dock bäras under hela laborationen.


Citratbuffertar

Man kan visserligen köpa citratbuffertar från olika kemikalieföretag, men det är lätt att göra dem själv enligt nedanstående recept.

Börja med att göra en stamlösning med 0,1 M citronsyra och en med 0,1 M trinatriumcitrat. Gör såhär:

0,1 M citronsyra

  1. Lös 9,61 g citronsyra (M = 192,15 g/mol) i 400 ml avjonat vatten i en 500 ml mätkolv.
  2. Tillsätt vatten upp till 500 ml.

0,1 M trinatriumcitrat

  1. Lös 14,61 g trinatriumcitrat dihydrat (M = 294,12 g/mol) i 400 ml avjonat vatten i en 500 ml mätkolv.
  2. Tillsätt vatten upp till 500 ml.

Blanda buffertar

Tillred buffertarna genom att blanda dem i volymerna som anges nedan.

pH Vcitronsyra Vtrinatriumcitrat
4,0 62,5   ml 37,5 ml
4,8 41,7   ml 58,3 ml
5,6 21,8   ml 78,2 ml
6,3 7,30 ml 92,7 ml
7,0 1,80 ml 98,2 ml

Svar på frågor att besvara

Svar på frågorna finns här (kräver registrering).

 

 

Också intressant: