Magnus Ehingers undervisning

— Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete med mera.

DNA-molekylens syntes (inkl. PCR)

DNA-replikationen följer tre regler

När en cell ska dela sig och bli två, måste arvsmassan kopieras. Detta kallas för att DNA:t i cellen replikeras.

DNA-replikationen följer tre regler:

  1. Den är semi-konservativ
  2. Den börjar alltid på samma ställen
  3. Den sker alltid i 5'→3'-riktning

1. DNA-replikering är semikonservativ.

Den ena DNA-strängen tjänar som mall för syntes av den andra strängen

I replikationen bevaras den ena strängen, och en ny tillverkas.

Eftersom den ena strängen alltid bevaras, är replikationen semi-konservativ = "till hälften bevarande"

Detta föreslogs först av Watson & Crick, och bevisades vara sant av Matthew Meselson och Franklin Stahl i ett mycket elegant experiment år 1957.

  1. (Fråga eleverna: När var det nu Watson & Crick löste DNA:ts struktur?)
    • 1953

Meselsons & Stahls experiment

  1. E. coli fick växa i många generationer i ett medium, vars enda kvävekälla var NH4Cl, innehållande isotopen 15N.
  2. DNA isolerades från bakterierna, och visade sig ha c:a 1% högre densitet än "vanligt" DNA (figur (a), nedan).
  3. Några E. coli överfördes till medium som endast innehöll 14N, och tilläts fördubbla sig endast en ytterligare gång.
  4. DNA som nu isolerats hade högre densitet än "vanligt" DNA, men lägre än [15N]DNA:t.
    • Uppenbarligen hade här bildats [14N, 15N]hybrid-DNA.
  5. Detta var det egentliga beviset på att replikationen av DNA är semikonservativ (figur (b), nedan).
  6. Några E. coli överfördes till färskt medium, som endast innehöll 14N, och tilläts fördubbla sig ytterligare en gång.
  7. DNA som nu isolerats och centrifugerats i en CsCl-gradient, skilde sig i två band: Ett som endast innehöll [14N]DNA och ett som innehöll [14N, 15N]hybrid-DNA (figur (c), nedan).

Meselsons & Stahls experiment.Meselsons & Stahls experiment.

2. DNA-replikationen börjar alltid på samma ställen

Det ställe där DNA-replikationen börjar kallas origin (ORI).

Från startpunkten sprider sig replikationen i båda riktningarna (bidirektionellt)

En ursprungspunkt (origin) är inte bara var som helst i kromosomen, utan alltid en och samma punkt.

Detta upptäcktes av Ross Inman och hans medarbetare.

  1. DNA från fag λ denaturerades partiellt.
    • Vissa A=T-rika regioner denaturerades alltid först.
  2. Dessa fick fungera som riktmärken i DNA-molekylen
  3. Vid replikering kunde Inman se partiellt denaturerat DNA där de inte förväntade sig.
  4. Det replikerande DNA:t hade alltid samma plats i förhållande till de övriga riktmärkena i molekylen.

Sålunda: Replikering startar alltid på ett bestämt (eller flera bestämda) ställe i genomet.

Partiellt denaturerat λ-DNA.

Undersökningar av replikation av cirkulärt DNA visar att replikationen sker i två riktningar (bidirektionellt) (figur 3).

Hur en cirkulär kromosom replikeras.

3. DNA-syntes sker i 5'→3'-riktning och är semi-avbruten.

Att DNA-syntes sker i 5'→3'-riktning betyder att på den nysyntetiserade strängens 3'-kol sätts en ny nukleotidgrupp på.

Eftersom DNA är antiparallellt läses mallsträngen av i 3'→5'-riktning.

Detta innebär också med nödvändighet att replikeringen är bidirektionell.

Om nu DNA-syntes endast sker i 5'→3'-riktning, hur kan då båda strängarna kopieras samtidigt?

Eftersom DNA är antiparallellt, borde en sträng syntetiseras i 5'→3'-riktning och den andra i 3'→5'-riktning. Men det gör den inte!

Detta problem löstes av Reiji Okazaki och hans medarbetare på 1960-talet.

Den ena strängen, den s.k. ledande strängen (eng. leading strand) syntetiseras i ett svep, utan avbrott.

På den andra strängen, den s.k. släpande strängen (eng. lagging strand), syntetiseras nytt DNA i korta stycken, som i efterhand binds samman.

  1. Dessa korta stycken kallas idag ofta för Okazaki-fragment.

DNA-syntesen är alltså sammanhängande på ena DNA-strängen och avbruten på den andra. Man säger att DNA-syntesen är semi-avbruten.

Okazaki-fragment varierar i storlek från några hundra till några tusen nukleotider, beroende på celltyp.

En replikationsgaffel.

Oligonukleotider kan syntetiseras på konstgjord väg

Oligonukleotid = kort, enkelsträngat DNA (< 80 baser)

Viktiga redskap i biotekniska metoder.

Har Gobind Khorana uppfann en metod för att tillverka oligonukleotider på 1970-talet

I korthet går den ut på följande (överkurs):

  1. En nukleotid sätts via sin 3'-hydroxylgrupp fast på en stödpartikel av kisel. En skyddande grupp av DMT (dimetoxytrityl) sitter på 5'-hydroxylgruppen.
  2. Den skyddande DMT tas nu bort.
  3. Nästa nukleotid som skall läggas till, måse vara vad man kallar aktiverad vid 3'-hydroxylgruppen. Det innebär att man har satt på en särskilt reaktiv grupp. Likaledes måste 5'-hydroxylen vara skyddad av DMT.
  4. Nukleotiden läggs nu till den växande oligopeptiden
  5. Steg 2-4 upprepas tills man har fått den oligonukleotid man vill ha
  6. Skilj av oligonukleotiden från kiselstödet
  7. Färdigt!

Idag kan man rutinmässigt göra – och köpa – polymerer på upp till 80 nukleotider.

PCR - the Polymerase Chain Reaction

DNA-polymeras behöver:

En mall

En primer

I en replikationsgaffel består primern av RNA

Oligonukleotider kan också fungera som primerar!

Med hjälp av primerar kan man göra många kopior av ett visst DNA-segment

Att göra många kopior kallas att amplifiera DNA:t.

Anekdot: Vad är "nyttig" forskning?

I november 2002 publicerades en artikel i Nature från ett forskarlag i Lund. Man hade lyckats bevisa att en viss typ av nattfjäril faktiskt kunde se förger i mörker. I Sydsvenska Dagbladet Snällposten kommenterade en läsare ilsket det där, och ironiserade över att det var ju fantastiskt att man äntligen kunnat fylla denna lucka i hans kunskap.

På 1960-talet lyckades bakteriologen Thomas Brock isolera en liten bakterie från en het källa i Yellowstone National Park i USA. Han själv tyckte säkert att det var intressant att hitta en bakterie, Thermus aquatiqus, som kunde överleva och reproducera sig vid temperaturer nära 100°C.

Men man kan också föreställa sig att omvärlden indignerat skakade på huvudet åt något så fullkomligt ointressant. Som vi skall se, ligger Brocks upptäckt till grund för en industri som årligen omsätter 300 miljoner dollar (1999).

Slutsatsen: Den kloke funderar ett slag innan han fördömer forskning som "onödig" bara för att man inte kan se den omedelbara nyttan med den.

PCR-metoden uppfanns av Kary B. Mullis 1984. För detta fick han 1993 års Nobelpris i kemi.

Kary B. Mullis.Kary B. Mullis.Själva metoden:

  1. Två oligonukleotid-primerar måste tas fram (antingen syntetiseras, vilket är vanligast idag, eller framställas på annat vis).
  2. Den ena oligonukleotiden måste vara komplementär till ett ena DNA-strängen på ena sidan om den gen man önskar amplifiera, och den andra måste vara komplementär till den andra DNA-strängen på andra sidan om genen (figur 1).
  3. Oligonukleotiderna blandas tillsammans med en lämplig buffert med det DNA man vill amplifiera, och ett stort överskott av deoxynukleotider (dNTP:s), samt DNA-polymeras från Thermus aquaticus.
  4. Hela blandningen upphettas för att smälta DNA:t
    • Det är här finessen med Thermus aquaticus kommer in: Även hos denna bakterie finns ju DNA-polymeraser.
    • Dessa polymeraser är (förstås) så beskaffade att de kan överleva, eller rättare sagt, inte denatureras vid de höga temperaturerna i de heta källorna i Yellowstone National Park.
    • Därmed kan de också överleva vid de höga temperaturer som krävs för att smälta DNA:t!
  5. Därefter kyls det av något för att låta oligonukleotiderna ansluta till det enkelsträngade DNA:t
  6. Nu höjs temperaturen till DNA-polymerasets optimala temperatur, och de första nya DNA-strängarna syntetiseras.
  7. Hela proceduren från steg d-f upprepas ett antal gånger.
  8. Lägg märke till, att efter andra rundan skapas nya DNA-molekyler som endast är lika långa som avståndet mellan de två oligonukleotid-primerarna.
  9. Dessa "korta" DNA-molekyler kommer helt att dominera i antal efter ett antal rundor

Efter 25 rundor, har genen i fråga amplifierats bortåt 1 miljon gånger.
PCR-metoden

Varför var PCR-metoden värd ett nobelpris?

Den verkar ju rent av löjligt simpel!

Kanske är just enkelheten i den så estetiskt tilltalande...

Metoden är oerhört användbar: I nära nog allt arbete med DNA har man nytta av, eller är det till och med nödvändigt, att man först skaffar sig stora mängder av det intressanta DNA:t.

Man kan snabbt få fram mycket DNA, som man sedan kan jobba vidare med

Detta är av stor vikt när man sedan vill undersöka själva genprodukten (proteinet, som genen kodar för).

Ju mer DNA man har, desto lättare har man att kunna få fram protein av hög kvalitet.

Man kan binda misstänkta till en brottsplats

Man kan göra faderskapsanalyser

Man kan göra släktskapsanalyser

  1. Både om t.ex. man är släkt med kungen, och om t.ex. hundar är mer släkt med sjakaler än vad katter är.