Ett brott har begåtts. Tillsammans ska ni i er grupp ta reda på vem som är skyldig till brottet. Till er hjälp har ni DNA från brottsplatsen och DNA från offret och två misstänkta.
Inledning
Restriktionsenzym är enzymer som känner igen en viss sekvens av basparen i DNA. Restriktionsenzymerna klipper upp DNA:t vid denna sekvens.
Exempelvis klyver restriktionsenzymet BamHI sekvensen:
5'-GGATCC-3'.
Sekvensen på den andra strängen är då:
3'-CCTAGG-5'.
Med restriktionsenzymers hjälp kan forskare klippa sönder DNA från olika celler. De delar av DNA som får härur kallas restriktionsfragment. Dessa kan man klistra ihop genom att använda sig av speciella enzymer. På så vis kan man klippa ut gener från en organism och klistra in dem i en annan. Upptäckten av restriktionsenzym har gjort det möjligt att skapa många kopior av en gen.
Brottsplats.
Restriktionsfragmenten är olika stora eftersom annorlunda enzym klipper inte DNA:t på samma sätt och bandmönstret i gelen är därför olika
DNA-fragment av olika storlek vandrar olika fort i gelen. Små fragment hindras inte lika mycket som stora av nätverket av agaros i gelen, och hinner vandra ganska långt på en viss tid. Stora fragment, som ständigt hindras av gelen, hinner inte vandra lika långt på samma tid. Därmed separeras de olika fragmenten med avseende på sin storlek. Vandringssträckan i gelen kommer då att vara omvänt proportionell mot logaritmen på DNA-molekylens storlek.
Genom att blanda etidiumbromid, EtBr, i agarosgelen, kan man se sitt DNA i agarosgelen på ett UV-bord. Etidiumbromiden interkalerar nämligen i DNA (kilar in sig mellan kvävebaserna), och gör att DNA fluorescerar i UV-ljus. Eftersom det interkalerar med DNA är det mycket mutagent, och man måste ha handskar på sig när man laborerar med det.
Material
Varje grupp behöver:
- Mikropipetter för 50 och 100 ml med tillhörande spetsar.
- Destillerat vatten
- Ett eppendorfrör med restriktionsenzymet HindIII
- DNA från brottsplatsen (Läraren förser er med detta), DNA från offret (rött), DNA från de båda misstänkta (grönt och blått)
- Laddningsfärg (Bromfenolblå)
- Skyddshandskar av vinyl el. latex
- Skyddsglasögon
Gemensamt behövs:
- Mikrocentrifug
- Mikrovågsugn
- 200 ml agarosgel, 0,8% i TBE
- Handskydd
- 500 x EtBr-lösning
- UV-bord
Utförande
- Tillsätt 100 ml destillerat vatten till röret innehållande restriktionsenzym. Stäng locket och knäpp med fingrarna på rörets sida för att blanda innehållet. Gör detta i en minut. All vätska ska vara vid botten. Låt röret stå i ytterligare några minuter. Lösningen ska se lite grumlig ut.
- Tillsätt 20 ml av detta till vart och ett av de tre rören med DNA. Tänk på att byta spets mellan gångerna så att rören inte kontamineras. Låt rören stå fem minuter och se sedan till att innehållet blandas genom att knäppa på röret i en minut.
- Inkubera alla fyra rören i 37 °C i 30- 45 minuter. Knäpp på rören varje 15 minut för att försäkra er om att lösningen är blandad.
- Smält 200 ml agarn under överinseende i mikrovågsugn. Skaka flaskan några gånger under smältningen, så blir agaroslösningen homogen.
- Sätt på skyddsglasögonen och skyddshandskar.
- Tillsätt lämplig mängd 500xEtBr när gellösningen svalnat så pass mycket att man kan hålla flaskan i handen utan att bränna sig.
- Häll den smälta agaroslösningen i i gelgjutningskärlet, och sätt i en s.k. kam. När gelen stelnat, och kammen avlägsnats, bildas små håligheter i gelen som kallas brunnar. Det är i dessa brunnar de fem löningarna lösningarna från rören ska appliceras.
- Låt gelen stå i 20-30 minuter för att stelna helt.
- Tillsätt 2 μl laddningsfärg (bromfenolblå) till alla tre rören då inkuberingstiden är över. Blanda noggrant genom att knäppa med fingrarna på röret.
- Häll på så mycket TBE-buffert att gelen är täckt med 2-3 mm buffert. Dra därefter försiktigt upp kammen, så att brunnarna fylls med buffert.
- För med hjälp av en mikropipett över varje rörs lösning till varsin brunn. Glöm inte att anteckna i vilken brunn ni applicerat just era lösningar och vilken som representerar vems DNA.
- Anslut lock och spänningsaggregat till gelgjutningskärlet. Var noga med att ha pluspolen mot den delen av gelen, dit DNA: t ska vandra (DNA-molekylen är ju negativt laddad). Ställ in spänningsaggregatet på 200V/80mA.
- När laddningsfärgen nått kanten av gelen, kan elektroforesen avbrytas. Det tar omkring 25 minuter.
- Analysera gelen på ett UV-bord. Rita av den eller, om möjligt, ta ett foto av den.
DNA-fragment kluvna med HindIII.
Fundera på!
- Vem är brottslingen?
- Vad grundar ni detta på?
Säkerhet
Laborationen är tämligen riskfylld, eftersom vi använder oss av etidiumbromid. Smält agaros är mycket varm, och kan orsaka brännskador. Spänningsaggregatet får på inga villkor kopplas på annat sätt än det är tänkt för, och den spänning tillverkaren av elektroforeskärlet rekommenderar får inte överstigas. Etidiumbromid är starkt cancerogent, och måste handhas därefter.
