Magnus Ehingers undervisning

— Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete med mera.

Analys av proteininnehållet i olika matvaror

Inledning

Ost innehåller relativt stora mängder protein. Ost innehåller relativt stora mängder protein. Proteiner ingår i allt levande material, och därmed även i den mesta mat vi äter. Olika typer av mat innehåller olika proteiner och också olika mycket protein. För att separera proteiner från varandra eller analysera proteininnehållet i en lösning eller ett prov använder man sig ofta av elektrofores. I den här laborationen ska du extrahera protein från några olika matvaror och analysera dem med elektrofores.

Proteiner i en lösning analyseras idag vanligen med polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). Akrylamid, som man gör gelerna av, är ett farligt nervgift, varför jag rekommenderar att eleverna inte själva gjuter sina polyakrylamidgeler. Istället bör läraren gjuta gelerna, eller också kan man köpa in färdiggjutna geler. Man kan också analysera sina proteiner på en 3%-ig agarosgel.

Tid för detta

Laborationen tar ett labtillfälle i anspråk för att göra proteinproverna och sätta igång elektroforesen. Själva elektroforesen tar 2 eller flera timmar, och in- och avfärgning likaså.

Material

Varje grupp behöver:

  • Ett eller flera prov att extrahera proteiner från (proteinprover). Lämpligt kan vara bitar från fisk, kött, ost eller liknande. Provet ska inte vara större än ett halvt riskorn.
  • Färdigspädd reducerande provbuffert
  • 1 eppendorfrör per proteinprov
  • Proteinstorleksmarkör. Lämplig mängd, och om den behöver spädas i provbuffert och denatureras anges av tillverkaren.
  • Märkpenna
  • Flytblock av frigolit
  • Kokande vattenbad
  • Färdiggjuten 8 % polyakrylamidgel eller 3 % agarosgel (Eventuellt kan flera labgrupper dela på en gel.)
  • Elektroforeskärl för den typ av gel som skall användas
  • Spänningsagreggat
  • SDS-PAGE elektroforesbuffert (till polyakrylamidgelen) eller 1× TB-buffert (till agarosgelen)
  • Mikropipett, 50 μl + pipettspetsar
  • Mikropipett, 1000 μl + pipettspetsar
  • Coomassie Brilliant Blue infärgningslösning
  • Plastburk m. lock (t.ex. petriskål), stor nog att kunna ha gelen i
  • Avfärgningslösning

Gemensamt behövs:

  • Bordsskak 

Gör såhär

  1. Sätt igång vattenbadet. Förbered proteinprovet enligt nedan medan du väntar på att det kokar upp.
  2. Lägg proteinproverna i eppendorfrören och tillsätt 0,5 ml 1× reducerande provbuffert till varje rör.
  3. Stäng locken och märk rören på respektive lock.
  4. Knäpp kraftigt med fingret på varje rör, så att innehållet blandas. Det som sker nu är att proteiner extraheras ur provet.
  5. Sätt rören i flytblocket, och placera alltsammans i det kokande vattenbadet i 3 minuter. Det som händer i det här steget är att alla proteinerna i provet denatureras, vilket gör att man får skarpare band på gelen när man sedan kör den.
  6. Tag upp rören ur vattenbadet och låt dem stå i 5 minuter för att fasta partiklar skall sjunka till botten. Eventuellt kan man centrifugera rören i en bords- eller mikrocentrifug.
  7. Häll buffert över gelen, så att ytan är 2-3 mm ovanför kanten/gelens yta. Tag försiktigt loss kammen.
  8. Tillsätt storleksmarkören till en utav brunnarna och proven till till övriga brunnar. Anteckna i vilken brunn du satt vilket prov.
  9. Kör gelen enligt geltillverkarens anvisningar. Avbryt elektroforesen när färgen i provbufferten nått den bortre/nedre änden av gelen. Det kan ta 2 eller fler timmar.
  10. Häll av elektroforesbufferten och lägg gelen i destillerat eller avjonat vatten i en timme. Byt vatten minst en gång under denna tiden. Det är viktigt att få bort så mycket som möjligt av bufferten innan man färgar in gelen.
  11. Lägg gelen i plastburken och häll så mycket Coomassie brilliant blue infärgningslösning över gelen att den täcks. Placera plastburken på skaken, och låt gelen färgas in 30 minuter (polyakrylamidgel) eller över natten (agarosgel).
  12. Avfärga gelen på skabord i avfärgningslösningen tills banden framträder så tydligt som möjligt. Det kan ta upp till 4-6 timmar. Byt avfärgningslösning varannan till var tredje timme.
  13. Polyakrylamidgeler kan man sedan torka mellan cellofanpapper i en torkställning eller lägga mellan OH-papper (plastfilm) och scanna av. Agarosgeler kan man fotografera av.

Frågor att besvara

  1. Vad fyller SDS för funktion i elektroforesen?
  2. I vilket storleksområde fanns de flesta proteinerna från era prov?
  3. Hur skiljer sig proteininnehållet åt i era olika prov?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld. Både den reducerande provlösningen och in- och avfärgningslösningen är frätande, varför skyddsglasögon och labrock måste bäras. Polyakrylamidgelen är inte skadlig, men rester av opolymeriserad akrylamid kan finnas kvar. Därför bör man ha skyddshandskar på när man handskas med gelen. Det gäller även under infärgningen av gelen, fast då mest för att slippa få färg på fingrarna.

Tillkännagivande

Den här laborationen har jag inte kommit på själv, utan först läst om hos NCBE:s "Protein power". Jag har dock skrivit om den och anpassat den till mina behov.