Magnus Ehingers undervisning

Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete m.m.

Bioteknik

Administration

Plasmidpreparation

Inledning

På samma sätt som det är viktigt att kunna föra in ett DNA-segment i en bakterie, kan det vara bra att också kunna isolera det DNA man fört in. I den här laborationen ska du preparera fram plasmider från de bakterier du själv transformerat i laboration 8 eller från inköpta bakterier, vilka innehåller plasmid. Man kan förstås också preparera plasmider från både egna transformerade bakterier och inköpta, och använda de inköpta bakterierna som positiv kontroll.

Tid för detta

Laborationen tar ett labtillfälle i anspråk för preparation av plasmid-DNA, och 1-2 tillfällen för analys med agarosgelelektrofores. Vid första tillfället ingår en del väntetider vid centrifugering, samt 15-30 minuters väntan vid fällning av DNA:t. Under elektroforesen blir det som innan en del väntetider.

Särskilda förberedelser

  1. Sätt en flytande kultur med plasmidinnehållande bakterier dagen innan laborationen. Man kan plocka kolonier från de bakterier som transformerats i laborationen Bakteriell transformation, men andra plasmidinnehållande E. coli-stammar går också bra. Viktigt är att plasmiden har ett högt kopietal, d.v.s. att den finns i många upplagor i varje cell.

    Odlingsmediet måste innehålla ett antibiotikum för att plasmiden skall finnas kvar i alla bakterier. Om man använder bakterierna från Bakteriell transformation ska man alltså ha med ampicillin i mediet. Tillsätt 1 ml ampicillinlösning till 500 ml odlingsmedium.

Material

Varje grupp behöver

  • plasmidinnehållande bakterier från en tät övernattskultur
  • 100 μl GET-buffert (glukos-EDTA-Tris-buffert)
  • 200 μl SDS/NaOH-lösning
  • 150 μl kaliumacetatbuffert
  • 15 μl TE-buffert
  • 400 μl iskall 95%-ig etanol
  • Laddningsfärg, 10×
  • 2 st eppendorfrör, sterila
  • Mikropipett, 50 μl + pipettspetsar
  • Mikropipett, 200 μl + pipettspetsar
  • Mikropipett, 1000 μl + pipettspetsar
  • Krossad is i en papp- eller frigolitmugg
  • Ympnål
  • Sterilt odlingsmedium (NB eller LB) eller steril 0,9% NaCl-lösning
  • etanol, 70 % eller annat ytdesinfektionsmedel
  • etanol, 95 % i –20°C
  • Spritlåga eller bunsenbrännare
  • Slaskbägare med desinfektionslösning
  • Ställ för eppendorfrör
  • Material till agarosgelelektrofores.

Gemensamt behövs

  • Mikrocentrifug
  • Frys, –20 °C
  • Hårtork eller geltork

Gör såhär

  1. Sterilisera din arbetsyta med 70%-ig etanol, och tänd spritlågan.
  2. För över 1 ml av bakteriesuspensionen till det ena eppendorfröret. Tänk på att arbeta sterilt, så att inte bakteriesuspensionen kontamineras!
  3. Centrifugera ner bakterierna i mikrocentrifugen på maxhastighet i en minut. Tänk på att balansera centrifugen! En 2-3 mm tjock pellet skall ha bildats i botten av eppendorfröret. Nu behöver du inte längre arbeta sterilt.
  4. Häll försiktigt av all överlösningen i slaskbägaren. Sug upp det allra sista av överlösningen med en pipett.
  5. Tillsätt 100 μl GET-buffert. Resuspendera cellerna i bufferten antingen genom att försiktigt suga cellerna upp och ner i pipetten några gånger, eller genom att stänga locket och sedan knäppa ordentligt på eppendorfröret med fingret några gånger.

    GET-bufferten innehåller bl.a. EDTA, som kelatbinder Mg2+- och Ca2+-joner. Då fungerar inte längre cellens DNas, ett enzym som bryter ner DNA, eftersom detta enzymet behöver Mg2+- och Ca2+-joner för att kunna fungera. Därigenom säkerställer man att plasmiderna inte bryts ner under preparationen. När jonerna försvinner ur lösningen, minskar också cellmembranens stabilitet.

  6. Tillsätt 200 μl SDS/NaOH-lösning till bakteriesuspensionen, och blanda försiktigt genom att vända röret upp och ner några gånger.
  7. Ställ röret i stället och låt det stå i rumstemperatur i 5 minuter. Under denna tid kommer du att se hur lösningen klarnar. Det beror på att SDS, som är en kraftig detergent, löser upp proteiner och fosfolipider som finns i cellernas membran. Cellerna lyseras då, och släpper ut allt sitt innehåll i lösningen.
  8. Tillsätt 150 μl kaliumacetatbuffert till de lyserade cellerna. Kaliumacetatbufferten återställer pH till det normala, samtidigt som det fäller ut SDS-saltet tillsammans med proteinerna, lipiderna och större DNA-molekyler (såsom kromosomen).
  9. Centrifugera de lyserade cellerna i maxhastighet i 5 minuter. Glöm inte att balansera centrifugen. Vid centrifugeringen samlas alla cellrester och kromosomalt DNA i pelleten, medan plasmid-DNA:t finns kvar i överlösningen.
  10. För försiktigt över den plasmidinnehållande överlösningen till det andra eppendorfröret. Var noga med att inte ta med något av pelleten. Du behöver inte vara lika noggrann som innan med att få med all överlösning.
  11. Du skall nu fälla ut allt DNA i lösningen. Det gör du genom att tillsätta 400 μl iskall 95%-ig etanol.
  12. Stäng locket till eppendorfröret och vänd det upp och ner ett par gånger. Du kan nu eventuellt se det utfällda DNA:t som mjölkaktiga slöjor i röret.
  13. Sätt in eppendorfröret med det utfällda DNA:t i frysen (–20°C) i 15-30 minuter.
  14. Centrifugera röret med DNA i 10 minuter i maxhastighet. Det fällda DNA:t kommer att samlas i en nätt och jämnt synlig pellet. Ett bra tips är att placera eppendorfröret med gångjärnet utåt i centrifugen, så vet du var du bör se din pellet.
  15. Häll mycket försiktigt av överlösningen i slaskbägaren, utan att få med något av pelleten. Sug upp vad du kan av det sista med en mikropipett.
  16. Värm eppendorfröret med en hårtork eller geltork, så att det allra sista av etanolen avdunstar.
  17. Lös upp pelleten i 15 μl TE-buffert. Det kan behövas rätt kraftigt blandande eller knäppande med fingret för att få pelleten att lösa sig. Om man inte får pelleten att lösa sig, kan man pröva att dra lösningen upp och ner i mikropipett några gånger. Detta ska dock ses som en sista utväg, då det kan medföra att DNA-molekylerna brister.
  18. Tillsätt 1,7 μl 10× laddningsfärg till den upplösta pelleten.
  19. Plasmiderna kan nu sparas i frys till nästa laborationstillfälle.
  20. Analysera dina plasmider med agarosgelelektrofores. Stanna elektroforesen när laddningsfärgen vandrat ungefär 1/3 av gelens längd.

    Du bör kunna se tre band på gelen (förutom laddningsfärgen): Det som har vandrat kortast sträcka består av plasmider i en avslappnad cirkulär form. Det som har vandrat något längre består av lineära plasmider, alltså plasmider som av någon anledning gått sönder under preparationen. Det band som har vandrat längst består av ciruklära plasmider, men i starkt hoptvinnad form. I och med att de är hoptvinnade, stöter de på mindre motstånd i agarosgelen, och vandrar därmed fortare.

Frågor att besvara:

  1. Vad fyller GET-bufferten för funktion?
  2. Vad fyller SDS/NaOH-lösningen för funktion?
  3. Vad fyller den iskalla, 95%-iga etanolen för funktion?
  4. Hur såg er gel ut? Rita eller fotografera av den!
  5. Såg er gel ut som ni förväntade er? Varför/varför inte?
  6. Lyckades ni preparera fram plasmiderna? Varför/varför inte?

Riskanalys

Laborationen är måttligt riskfylld om man färgar in gelen med Sybr Safe, och riskfylld om man färgar in den med etidiumbromid. SDS/NaOH-lösningen och kaliumacetatlösningen kan visserligen vara skadliga, men i de små mängderna som används i denna laboration är det inte mer än måttligt riskfyllt. Som vid allt arbete med bakterier, ska man ha labrock på sig. Etanol som förvaras i frysen måste av brandsäkerhetsskäl vara i en lufttät behållare om man inte har en gnistsäker frys.

 

   

Också intressant: