Inledning
För att analysera makromolekyler använder man ofta en metod som kallas för elektrofores. Det går ut på att man separerar molekylerna med hjälp av ett elektriskt fält. När man ska separera DNA-fragment från varandra är det mycket vanligt att man sätter sitt DNA i en gel av agaros, en slags polysackarid, och lägger på en spänning över gelen. Långa DNA-snuttar kommer att bromsas mera av gelen, medan kortare fragment vandrar snabbare genom gelen.
I den här labinstruktionen beskrivs hur man gjuter och använder s.k. minigeler (8×10 cm) för att göra agarosgelelektrofores. För andra storlekar måste jag hänvisa till respektive tillverkare.
På skolan använder vi Sybr Safe för att kunna se DNA-banden i UV-ljus. På forskningslab världen över används ofta etidiumbromid istället, eftersom det är mer känsligt. På grund av att det är så pass cancerframkallande rekommenderar jag dock Sybr Safe till skolarbete.
Material
- Mätcylinder, 500 ml
- Mätcylinder, 100 ml
- E-kolv, 250 ml
- Mikrovågsugn
- Två gjutformar till minigeler (8×10 cm) + hållare
- Två kammar, lämpligen 12 brunnar
- Elektroforeskärl m. lock och sladdar
- Mikropipett, 5–50 μl + pipettspetsar
- Våg
- Vågskepp
- Spänningsaggregat
- UV-bord
- Kamera
- 10× TBE-buffert
- Agaros (electrophoresis grade)
- 10.000× Sybr Safe
Tillred agarosgelen (2 st. geler, 1 % agaros)
- Späd 50 ml 10× TBE-buffert till 500 ml
- 100 ml av bufferten ska användas till själva gelen, resten används vid själva elektroforesen
- Mät upp 100 ml av den spädda bufferten i en 250 ml E-kolv
- Väg upp 1 g agaros och häll i E-kolven
- Värm E-kolven i mikrovågsugn, så att agarosen smälter. Håll ett öga på den, så att den inte kokar över!
- Snurra E-kolven försiktigt, så att agarosen blandas om
- När kolven har svalnat så mycket att du kan hålla den i handen utan att bränna dig, tillsätt 10 μl 10.000× Sybr Safe.
Gjut gelen
- Montera gjutformarna i hållarna (eller tejpa för ändarna på gjutformen, om du inte har någon hållare).
- Fördela den smälta agarosen på i de två gjutformarna
- Sätt i en kam i vardera gjutform
- Låt gelerna stelna
- Om du inte behöver dem bums, går det bra att stoppa de stelnade gelerna i en plastpåse och förvara dem i kyl i 1-2 dagar.
Ladda proverna och kör gelen
Hur man sätter på DNA-prover på en agarosgel.
- Lossa gjutformen ur hållaren (eller ta bort tejpbitarna på sidorna), och placera den i elektroforeskärlet
- Häll så mycket TBE-buffert i elektroforeskärlet så att gelen är täckt med 2-3 mm buffert
- Dra försiktigt ut kammen, så att buffert sugs in i brunnarna
- Tillsätt DNA-markör och prover till brunnarna i gelen
- Sätt på locket och koppla sladdarna till spänningsaggregatet. Var noga med att koppla (+)-polen till den ända som DNA-molekylerna ska vandra mot!
- För riktigt fina geler bör man inte ha högre spänning än 5 V/cm. Det betyder att om elektroderna är 10 cm ifrån varandra, så ska man lägga på en spänning på 50 V.
- På skolan har vi dock inte alltid tid att vänta så länge, och jag har kört geler med en spänning på upp till 20 V/cm med hyfsade resultat. Då är det dock extremt viktigt att elektroforeskärlet är mycket väl kylt!
- Avbryt elektroforesen när laddningsfärgen har vandrat en god bit in i gelen, eller till och med är på väg att vandra ut ur den.
- Lägg gelen på ett UV-bord och fotografera av den för vidare analys.
Riskanalys
- Allt förbrukat material går att slänga i de vanliga soporna (förutsatt att man inte använt etidiumbromid). Häll ingen överbliven agarosgel i vasken, då den riskerar klogga igen avloppet.
- Var försiktig med den smälta agarosen, som kan vara mycket varm.
- Använd skyddsglasögon eller visir vid längre tids arbete vid UV-bordet för att undvika brännskador på huden och ögonene.
