En DNA-lösning vid pH 7 och normal temperatur är mycket viskös, dvs. "sirapsseg". Om man ändrar pH eller höjer temperaturen, kan lösningens karaktär ändras dramatiskt: Viskositeten avtar.
- Uppenbarligen sker något med DNA:ts struktur!
Denaturering och renaturering av DNA
Precis som proteiner kan denatureras, kan också DNA (och RNA) denatureras. I första hand bryts vätebindningarna mellan kvävebaserna upp (se nedan).
Denaturering och renaturering av DNA.
Vi går från dubbelsträngat DNA (dsDNA) till enkelsträngat DNA (ssDNA).
Först vid ännu högre temperaturer får vi en nedbrytning av de enskilda DNA-strängarna. Denna nedbrytning är inte reversibel, d.v.s. har DNA brutits ner, byggs det inte upp igen utan vidare.
DNA:ts halvsmältpunkt beror på mängden AT- och GC-par. Den relativa mängden enkel- eller dubbelsträngat DNA kan bestämmas genom att mäta ljusabsorbansen (den optiska densiteten, OD) vid 260 nm med hjälp av spektrofotometri.
- När DNA är dubbelsträngat, är de aromatiska kvävebaserna mindre tillgängliga för UV-ljus än när DNA är i enkelsträngad form.
- Det innebär att enkelsträngat DNA absorberar mer UV-ljus än dubbelsträngat
Genom att mäta OD260 över ett temperaturområde, kan man avgöra vid vilken temperatur 50% av DNA som är denaturerat. Denna temperatur kallas transitionstemperaturen eller övergångstemperaturen, och skrivs Tm (nedan).
Ofta talar man också om att smälta DNA när man egentligen borde säga denaturera det. Övergångstemperaturen kallas ibland också halvsmältningstemperaturen.
Tre saker påverkar en DNA-molekyls övergångstemperatur
1. Lösningens jonstyrka.
2. Längden på DNA-molekylen
3. Sammansättningen av kvävebaser
Guanin och cytosin hålls samman i dsDNA med hjälp av tre vätebindningar.
- Det skrivs ofta G≡C.
Adenin och tymin hålls bara samman av två vätebindningar i dsDNA (A=T).
Detta innebär att bindningen mellan G och C är starkare än mellan A och T. Därför blir övergångstemperaturen högre, ju högre GC-innehåll en DNA-molekyl har.
Genom att mäta övergångstemperaturen för olika DNA-molekyler under kontrollerade förhållanden kan man uppskatta mängden GC i en DNA-molekyl.
Dubbelsträngat RNA eller (dubbelsträngade) hybrider mellan RNA och DNA kan också denatureras, på precis samma sätt.
Avslappnat DNA...
