Oligonukleotider kan syntetiseras på konstgjord väg
Oligonukleotid = kort, enkelsträngat DNA (< 80 baser)
Viktiga redskap i biotekniska metoder.
Har Gobind Khorana uppfann metod för att tillverka oligonukleotider på 1970-talet
I korthet går den ut på följande (överkurs):
- En nukleotid sätts via sin 3'-hydroxylgrupp fast på en stödpartikel av kisel. En skyddande grupp av DMT (dimetoxytrityl) sitter på 5'-hydroxylgruppen.
- Den skyddande DMT tas nu bort.
- Nästa nukleotid som skall läggas till, måse vara vad man kallar aktiverad vid 3'-hydroxylgruppen. Det innebär att man har satt på en särskilt reaktiv grupp. Likaledes måste 5'-hydroxylen vara skyddad av DMT.
- Nukleotiden läggs nu till den växande oligopeptiden
- Steg 2-4 upprepas tills man har fått den oligonukleotid man vill ha
- Skilj av oligonukleotiden från kiselstödet
- Färdigt!
Idag kan man rutinmässigt göra – och köpa – polymerer på upp till 80 nukleotider.
PCR - the Polymerase Chain Reaction
DNA-polymeras behöver:
En mall
En primer
I en replikationsgaffel består primern av RNA
Oligonukleotider kan också fungera som primerar!
Med hjälp av primerar kan man göra många kopior av ett visst DNA-segment
Att göra många kopior kallas att amplifiera DNA:t.
Anekdot: Vad är "nyttig" forskning?
I november 2002 publicerades en artikel i Nature från ett forskarlag i Lund. Man hade lyckats bevisa att en viss typ av nattfjäril faktiskt kunde se färger i mörker. I Sydsvenska Dagbladet Snällposten kommenterade en läsare ilsket det där, och ironiserade över att det var ju fantastiskt att man äntligen kunnat fylla denna lucka i hans kunskap.
På 1960-talet lyckades bakteriologen Thomas Brock isolera en liten bakterie från en het källa i Yellowstone National Park i USA. Han själv tyckte säkert att det var intressant att hitta en bakterie, Thermus aquatiqus, som kunde överleva och reproducera sig vid temperaturer nära 100°C.
Men man kan också föreställa sig att omvärlden indignerat skakade på huvudet åt något så fullkomligt ointressant. Som vi skall se, ligger Brocks upptäckt till grund för en industri som årligen omsätter 300 miljoner dollar (1999).
Slutsatsen: Den kloke funderar ett slag innan han fördömer forskning som "onödig" bara för att man inte kan se den omedelbara nyttan med den.
PCR-metoden uppfanns av Kary B. Mullis 1984. För detta fick han 1993 års Nobelpris i kemi.
Kary B. Mullis. Själva metoden:
- Två oligonukleotid-primerar måste tas fram (antingen syntetiseras, vilket är vanligast idag, eller framställas på annat vis).
- Den ena oligonukleotiden måste vara komplementär till ett ena DNA-strängen på ena sidan om den gen man önskar amplifiera, och den andra måste vara komplementär till den andra DNA-strängen på andra sidan om genen.
- Oligonukleotiderna blandas tillsammans med en lämplig buffert med det DNA man vill amplifiera, och ett stort överskott av deoxynukleotider (dNTP:s), samt DNA-polymeras från Thermus aquaticus.
- Hela blandningen upphettas för att smälta DNA:t
- Det är här finessen med Thermus aquaticus kommer in: Även hos denna bakterie finns ju DNA-polymeraser.
- Dessa polymeraser är (förstås) så beskaffade att de kan överleva, eller rättare sagt, inte denatureras vid de höga temperaturerna i de heta källorna i Yellowstone National Park.
- Därmed kan de också överleva vid de höga temperaturer som krävs för att smälta DNA:t!
- Därefter kyls det av något för att låta oligonukleotiderna ansluta till det enkelsträngade DNA:t
- Nu höjs temperaturen till DNA-polymerasets optimala temperatur, och de första nya DNA-strängarna syntetiseras.
- Hela proceduren från steg d-f upprepas ett antal gånger.
- Lägg märke till, att efter andra rundan skapas nya DNA-molekyler som endast är lika långa som avståndet mellan de två oligonukleotid-primerarna.
- Dessa "korta" DNA-molekyler kommer helt att dominera i antal efter ett antal rundor
Efter 25 rundor, har genen i fråga amplifierats bortåt 1 miljon gånger.
Bra video som förklarar PCR-metoden:
Varför var PCR-metoden värd ett nobelpris?
Den verkar ju rent av löjligt simpel!
Kanske är just enkelheten i den så estetiskt tilltalande...
Metoden är oerhört användbar: I nära nog allt arbete med DNA har man nytta av, eller är det till och med nödvändigt, att man först skaffar sig stora mängder av det intressanta DNA:t.
Man kan snabbt få fram mycket DNA, som man sedan kan jobba vidare med
Detta är av stor vikt när man sedan vill undersöka själva genprodukten (proteinet, som genen kodar för).
Ju mer DNA man har, desto lättare har man att kunna få fram protein av hög kvalitet.
Man kan binda misstänkta till en brottsplats
Man kan göra faderskapsanalyser
Man kan göra släktskapsanalyser
- Både om t.ex. man är släkt med kungen, och om t.ex. hundar är mer släkt med sjakaler än vad katter är.
