Magnus Ehingers undervisning

— Allt du behöver för A i Biologi, Kemi, Bioteknik, Gymnasiearbete med mera.

Storleks­kromatografi: Gel­filtrering

Inledning

För att kunna analysera ämnen i en blandning måste man ofta först separera dem från varandra. Det finns många olika s.k. kromatografiska metoder för att göra detta. En av dem är storlekskromatografi (gelfiltrering) där man separerar stora molekyler från mindre.

En gelfiltreringskolonn innehåller små kulor av en porös polysackarid. Stora molekyler, som exempelvis proteiner, slinker ganska fort förbi kulorna. Mindre molekyler åker däremot in och ut ur kulorna hela tiden, och bromsas då också upp mer.

I mjölk finns det förutom vatten en del mineraler, fett och vitaminer. Det finns också mjölkprotein (kasein) och mjölksocker (laktos). I den här laborationen ska du separera kaseinet från laktosen med hjälp av storlekskromatografi.

Kasein.

Laktos.

Kasein och laktos i samma relativa skala (ungefärligt).

Material

Varje grupp behöver

Kemikalier

  • Mjölk med låg fetthalt (lättmjölk eller minimjölk)
  • Fehlings lösning I och II
  • 0,9 % NaCl-lösning (elueringslösning)
  • 0,02 % NaN3-lösning

Annan materiel

  • Gelfiltreringskolonn
  • Stativ
  • Muff
  • Klämma
  • 2st graderade dropprör, 3 ml
  • Bägare, 25–50 ml
  • Bägare, 100 ml
  • Bägare, 250 ml
  • Märkpenna
  • 12 provrör av halvmikrotyp, numrerade 1-12
  • Provrörsställ
  • Brännare, trefot & trådnät alt. värmeplatta

Gör såhär

  1. Hämta ca. 5 ml mjölk i 50 ml-bägaren och ca. 100 ml NaCl-lösning i 250 ml-bägaren.
  2. Förbered kolonnen för eluering:
    1. Montera kolonnen i stativet och placera 100 ml-bägaren undertill.
    2. Ta bort först det övre locket och fyll kolonnen med 0,9 %-ig NaCl-lösning
    3. Ta bort den undre hylsan och låt det rinna igenom minst 5 ml NaCl-lösning OBS! Du får aldrig låta kolonnen gå torrt, utan måste hälla på mer elueringslösning så fort vätskeytan når kolonnmassans övre kant.
    4. Sätt på den undre hylsan.
  3. Sätt på provet:
    1. För över c:a 0,5 ml mjölk till kolonnen.
    2. Ta av den undre hylsan och låt mjölken rinna ner i kolonnen.
    3. Sätt på hylsan igen när vätskeytan når kolonnmassans övre kant.
  4. Eluera ut mjölken:
    1. Sätt det första provröret under kolonnen.
    2. Häll c:a 1 ml NaCl-lösning i kolonnen.
    3. Ta av den undre hylsan och samla upp dropparna.
    4. Samla c:a 1 ml i vart och ett av de 12 provrören. Fyll på med NaCl-lösning allteftersom vätskeytan når kolonnmassans övre kant.
  5. Återställ kolonnen (kan göras medan proven står i vattenbad, se nedan):
    1. Sätt åter 100 ml-bägaren under kolonnen.
    2. Skölj med minst 5 ml NaCl-lösning (eller NaN3-lösning om kolonnen inte ska användas snart igen).
  6. Analysera fraktionerna:
    1. Tillsätt 3 droppar Fehling I och Fehling II (eller 6 droppar av färdigt kopparreagens) till vart och ett av provrören.
    2. Häll vatten upp till 1 cm i 250 ml-bägaren och sätt försiktigt ner provrören.
    3. Värm vattnet över brännaren (eller på värmeplatta).
    4. Notera i vilka provrör du får positiv biuret-reaktion, och i vilka du får positiv reaktion från Trommers prov (Cu2+-jonerna reduceras till Cu+-joner).

Frågor att besvara

  1. Vad innebär ett positivt biuretprov?
  2. Vad innebär en positiv reaktion från Trommers prov?
  3. Vilket ämne eluerar ut först, kaseinet eller laktosen? Hur kan du se det?

Riskanalys

Fehlings lösning är basisk och därmed frätande. Därför ska labrock och skyddsglasögon bäras under hela laborationen. Om du får det på huden, skölj omedelbart med mycket vatten. Kopparjoner är skadliga för vattenmiljön, och får inte hällas ut i avloppet. Samla upp alla reaktionslösningar i ett kärl för tungmetaller.

Tillkännagivande

Den här laborationen har jag inte kommit på själv, utan inspirerats av från ett flertal andra källor. Jag har dock skrivit om den och anpassat den till mina behov.