Inledning
Enzymer fungerar genom att öppna en ny och snabbare reaktionsväg. Hur snabbt reaktionen sker beror dock på många olika saker. Det kan vara
- enzymets koncentration
- substratets koncentration
- lösningens pH
- temperatur
- närvaro/frånvaro av inhibitorer
- m.m.
I det här försöket ska ni undersöka hur lösningens pH påverkar enzymet fosfatas.
Fosfatas är ett enzym som katalyserar spjälkningen av en fosfatgrupp från en fosfatester. Det är ett relativt ospecifikt enzym, vilket innebär att många olika fosfatestrar påverkas av det. Detta ska ni utnyttja i den här laborationen, där ni ska hydrolysera p-nitrofenylfosfat till p-nitrofenol (se bilden nedan).
Det fina med att använda p-nitrofenylfosfat är att den är färglös, medan reaktionsprodukten p-nitrofenol är starkt gul i alkalisk lösning. Därför kan man lätt mäta p-nitrofenolkoncentrationen med hjälp av en spektrofotometer vid 405 nm. Eftersom absorbansen är proportionell mot koncentrationen p-nitrofenol, kan man jämföra hur mycket p-nitrofenol som bildas vid olika pH.
Material
Varje grupp behöver:
Kemikalier
- Enzymlösning: 3 ml fosfataslösning (surt fosfatas från potatis), 0,10 mg/ml. Denna ska förvaras på is tills den sätts ner i 37 °C-vattenbadet.
- Substratlösning: 3 ml p-nitrofenylfosfatlösning, 1,00 mg/ml
- 1,2 ml 0,1 M citratbuffert 1, pH = 4,0
- 1,2 ml 0,1 M citratbuffert 2, pH = 4,8
- 1,2 ml 0,1 M citratbuffert 3, pH = 5,6
- 1,2 ml 0,1 M citratbuffert 4, pH = 6,3
- 1,2 ml 0,1 M citratbuffert 5, pH = 7,0
- 30 ml 0,5 M NaOH
Annan materiel
- 6 provrör
- 6 plastkyvetter till spektrofotometern
- Vattenbad, 37 °C
- Märkpenna
- Mikropipett, 1000 μl + pipettspetsar
- Mätpipett, 5 ml
- Peleusboll eller motsvarande
- Provrörsställ
- Tidtagarur
- Parafilm
Gemensamt behövs:
- Spektrofotometer med wolframlampa (405 nm). Tänk på att spektrofotometern måste vara på minst en halvtimme innan den stabiliserats så att man kan ta upp tillförlitliga mätningar på den.
Gör såhär
- Märk de sex provrören från 1-6.
- För med hjälp av mikropipett över 0,4 ml substratlösning till vart och ett av de sex provrören.
- För med hjälp av mikropipett över 1,2 ml av citratbuffert 1 till rör nummer 1; 1,2 ml av citratbuffert 2 till rör nummer 2 och så vidare. Glöm inte att byta pipettspets mellan varje buffert!
- Tillsätt med hjälp av mikropipett 1,6 ml destillerat eller avjonat vatten till rör nr. 6 (blank).
- Sätt alla rören + enzymlösningen i vattenbadet, och låt dem stå där några minuter så att de värms upp till 37 °C.
- Klipp under tiden till 6 bitar parafilm, som passar över provrörens mynningar. (Du behöver inte klippa särdeles snyggt eller exakt.)
- För med hjälp av mikropipett över 400 μl av enzymlösningen till provrör nummer 1. Sätt på en bit parafilm, och blanda snabbt om lösningen. Starta samtidigt tidtagaruret.
- Efter 60 sekunder tillsätter du på samma vis enzymlösning till rör nummer 2, och så vidare ända till och med rör nummer 5.
- När exakt 10 minuter har gått, tillsätter du med hjälp av mätpipett 4 ml 0,5 M NaOH till det första röret. Då avbryts reaktionen. När exakt 11 minuter har gått gör du på samma sätt med rör nummer 2, och så vidare med alla de övriga provrören, och även rör nummer 6.
- För över 1–3 ml (beroende på vilken typ av kyvett som används) av reaktionslösningen i rör nummer 1 till en kyvett.
- Mät absorbansen vid 405 nm med lösningen i rör 6 som referens.
- Gör likadant med rör 2–5.
- Gör ett diagram där du sätter av absorbansen på y-axeln mot reaktionslösningens pH på x-axeln.
Frågor att besvara.
- Läs av ditt diagram. Vilket är fosfatasets pH-optimum (vid vilket pH sker reaktionen snabbast)?
- Vilket pH-optimum anger enzymtillverkaren att fosfataset har? Överensstämmer det med era mätningar? Varför/varför inte?
- Varför fungerar inte fosfataset lika bra vid alla pH?
- Varför är det viktigt att alla reaktionerna avbryts efter samma tid? Vad händer om man inte gör det?
Riskanalys
Laborationen är måttligt riskfylld. P-nitrofenylfosfat är giftigt vid förtäring och inandning, och kan också verka skadligt vid hudkontakt. NaOH i den koncentration och mängd som används i laborationen är frätande. Därför ska labrock och skyddsglasögon användas under hela laborationen.
Svar på frågor att besvara
Svar på frågorna finns här (kräver lärarinloggning).
