Vad innebär kromatografi?
Kromatografiska metoder är en typ av metoder för att separera molekyler i en blandning från varandra.
Man använder:
- En fast (stationär) fas som molekylerna kan binda till.
- En flytande (mobil) fas, som vandrar/rinner genom den fasta fasen, och drar med sig molekylerna.
Beroende på hur pass väl molekylerna binder till den fasta fasen, kommer de att eluera ut olika fort.
En kolonn för vätskekromatografi, LC.
En kolonn för högpresterande vätskekromatografi, HPLC.
LC och HPLC
LC = Liquid chromatography (vätskekromatografi).
HPLC = High performance liquid chromatography (högpresterande vätskekromatografi)
- Sker under högre tryck.
Den stationära fasen består av mikroskopiska kulor med till exempel långa kolvätekedjor påkopplade.
Ämnena separeras från varandra eftersom de löser sig olika bra i den stationära fasen.
- Ju mer ett ämne löser sig i den stationära fasen
- desto mer tid tillbringar ämnet i den stationära fasen;
- desto mer bromsas ämnet upp av den stationära fasen;
- desto längre tid tar det för ämnet att elueras ut.
Fördelningskonstant
Det uppstår en så kallad fördelningsjämvikt mellan ämnet N i den mobila fasen och den stationära fasen:
N(mobil) ⇌ N(stationär)
Ur detta kan vi definiera en fördelningskonstant, \(K_\mathrm{D}\):
\[K_\mathrm{D} = \frac {[N(\text{stationär})]}{[N(\text{mobil})]}\]
Ju mer ett ämne löser sig i den stationära fasen jämfört med den mobila, desto högre värde på \(K_\mathrm{D}\).
Hur LC (vätskekromatografi) fungerar.
I en HPLC skjuts provet man vill analysera in i en injektor. En högtryckspump pumpar elueringsvätska genom kolonnen. En detektor läser av när ett ämne passerar, vilket plottas i ett kromatogram i datorn. En fraktionssamlare samlar automatiskt upp proverna. Genom att koppla fraktionerna till kromatogrammet kan man se vilka provrör som innehåller vilka ämnen.
En GC (gaskromatograf) fungerar nästan precis som en HPLC, fast med skillnaden att att den mobila fasen består av kvävgas, N₂(g). Kolonnen är upprullad i en het ugn, så att alla prover förgasas. Kolonnen separerar ämnena framför allt med avseende på storlek, små molekyler före stora. Molekylerna förbränns i slutet av kolonnen, vilket detekteras och plottas i ett gaskromatogram.
Storlekskromatografi (gelfiltrering)
- Kolonnmassan: Gel av mikroskopiska porösa ”kulor”.
- Små molekyler kan gå in i kulorna, bromsas mer.
- Stora molekyler slinker förbi kulorna, rinner igenom fortare.
- ”Störst kör först”.
Porösa kulor i gelfiltreringskolonnen gör att stora molekyler elueras ut före små molekyler.
Affinitetskromatografi
Antikroppar är Y-formade proteiner som bildas av immunförsvaret hos alla däggdjur.
- Antikropparna har mycket hög affinitet för endast ett protein.
Vid affinitetskromatografi: Antikroppar kovalent bundna till den stationära fasen.
Principen för affinitetskromatografi. Vad som händer i a–d beskrivs i texten nedan.
Hur affinitskromatografi funkar
- En blandning av proteiner sätts till kolonnen.
- De eftersökta proteinerna binder till antikropparna.
- OBS: Bilden visar bara en modell, proteinet binder egentligen inte till "botten" av Y-et i antikroppen.
- De övriga proteinerna kan elueras ut eftersom det eftersökta proteinet är bundet till antikropparna.
- Elueringsvätskans pH eller salthalt förändras.
- Proteinernas (och antikropparnas) struktur förändras.
- Antikropparnas affinitet för proteinerna försämras.
- De eftersökta proteinerna släpper, och kan elueras ut.
Det upprenade proteinet blir mycket rent.
